通過抑制PDHK3的表達降低乳酸水平增加CHO細胞抗體表達量

李鵑，蔡潔行，張崢，朱煥章

（1.復旦大學，上海 200433；2.上海藥明生物技術有限公司，上海 200131）

隨著生物制藥行業的蓬勃發展，CHO細胞蛋白生產的需求日益增加[1]。細胞群批次補料可以在較短時間內提供克級以上蛋白用于研發等用途，因此其應用越來越廣泛[2]。批次補料過程中，各種代謝廢物也在培養體系中不斷堆積，造成細胞周圍環境逐漸惡化[3-5]，細胞活率降低，從而影響蛋白最終產量。

本研究針對丙酮酸脫氫酶激酶3（PDHK3）設計3組特定的shRNA（PDHK3-1、PDHK3-2、PDHK3-3），并將其分別克隆至WuXi Biologics載體中。為加強shRNA的抑制效果，將設計的3組shRNA以1∶1∶1進行混合，在CHO細胞群構建時將含有這些混合質粒與待表達蛋白的質粒一同轉染進入宿主細胞中。在批次補料實驗中發現，通過轉染8組不同的蛋白分子，批次補料過程中每一組的乳酸含量均得到明顯降低，同時蛋白表達量得到顯著提高。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、試劑盒與儀器

shRNA質粒提取使用試劑盒（MACHEREYNAGEL）；PDHK3基因mRNA水平檢測使用RTPCR試劑盒（Invitrogen）及PCR試劑盒（TaKaRa）；轉染過程使用電轉試劑（Lonza）。

Vicell細胞計數儀（Beckman，XR）、細胞培養生化分析儀（NoVa，FLEX）、高效液相色譜（HPLC）（Agilent，1260 Infinity Ⅱ）

1.1.2 質粒、菌株與宿主細胞

質粒、菌株、細胞系等宿主細胞CHOK1、WuXi Bio表達載體和感受態TOP10為WuXi Biologics平臺所有，PDHK3-shRNA及shRNA陰性對照的目的基因合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，含有PDHK3-shRNA或者shRNA陰性對照的目的基因由蘇州金唯智生物科技有限公司克隆至WuXiBio表達載體，完成重組菌株的制備。

1.1.3 引物與探針

1.1.3.1 PDHK3基因的mRNA水平檢測

正向引物：TGGCGAACACAATGAGAGAAGT；反向引物：TGCATGTACCAACTCTGAACTAATCC；探針：AATCTTTTGCCGGATAAC。

1.1.3.2 neomycin基因拷貝數檢測

正向引物：TGCCGAATATCATGGTGGAA；反向引物：GCCAAGCTCTTCAGCAATATCA；探針：TGGCCGCTTTTCT。

1.2 方法

1.2.1 shRNA質粒的構建

選取PDHK3的3個目的區域：5’-GGACTTCGGAAGAGATAATGC-3’（ORF 327～347）；5’-GCTACTCTGTGAACAGTATTA-3’（ORF 843～863）；5’-GCCCTTTCAAGTGAATCATTT-3’（ORF1306～1326）。

含有PDHK3基因的shRNA質粒設計為含有反向互補的目的基因序列，中間由一莖環（TTGATATCC）序列分割，組成短發夾結構。

同時設計含有陰性對照shRNA的質粒：GTCGC TTACCGATTCAGAATGGTTGATATCCGCCATTCTGA ATCGGTAAGCGAC。

合成以上基因序列，分別添加 5’（BamHI）、3’UTR（[ACATTGATTATTG]）和 3’（SpeI），將基因通過 5’BamHI和 3’SpeI克隆至載體 WuXi Bio 表達載體（Ampicillin），制備重組質粒DNA及重組菌株。

1.2.2 宿主CHOK1細胞培養

宿主CHOK1細胞使用搖瓶在CD CHO培養基中傳代培養，每隔3～4 d進行傳代，搖床培養條件為溫度36.5 ℃，二氧化碳濃度6.0%。

1.2.3 轉染CHO細胞并進行加壓篩選構建細胞系

使用電轉試劑（Lonza）進行轉染，轉染條件設置見表1。

表1 轉染條件設置

單獨轉染含有表達目的蛋白質粒，共轉含有針對PDHK3-shRNA（1+2+3）的混合質粒和含有表達目的蛋白質粒，單獨轉染含有陰性對照shRNA的質粒3種條件，8個蛋白分子共轉染24個細胞系。其中PDHK3-shRNA混合質粒中3個shRNA的比例為1∶1∶1。

轉染24 h后，通過加入含有相應抗生素的篩選培養基進行CHO細胞篩選，每隔2～4 d以0.7×105～3.0×105cells/mL 的密度進行傳代。經過2～3周傳代，細胞活率恢復到95%以上，篩選出能夠表達目的蛋白及shRNA-PDHK3的細胞系。

1.2.4 批次補料實驗及乳酸含量、抗體蛋白表達量檢測

篩選結束后，以3～7 E5密度接種搖管批次補料實驗，接種后根據細胞生長進行多次補料。Vicell細胞計數儀檢測細胞活率、細胞密度，NoVa儀直接檢測上清液中乳酸含量。第14 d收獲上清樣品，使用HPLC檢測各個抗體蛋白分子目的蛋白的表達量。

1.2.5 PDHK3基因mRNA水平檢測

收集批次補料細胞沉淀，提取總RNA并逆轉錄為cDNA。針對載體PDHK3基因區域設計引物和探針，利用qPCR方法檢測PDHK3的mRNA水平。宿主CHO細胞的B2M為內參基因，PDHK3與B2M檢測值的比值即可反映轉入shRNA-PDHK3的細胞PDHK3基因的mRNA水平的變化趨勢。

1.2.6 Neomycin基因拷貝數檢測

收集批次補料第0 d細胞沉淀以及批次補料過程第10 d的細胞沉淀，分別提取每個樣品的基因組DNA。針對載體Neomycin基因區域設計特定的引物和探針，利用ddPCR技術定量檢測Neomycin基因拷貝數，通過該基因的拷貝數間接反應PDHK3-shRNA的基因拷貝數情況。

2 結果與討論

2.1 批次補料抗體蛋白表達量

在14 d左右的搖管批次補料實驗中，于批次補料結束后收集上清液進行HPLC_ProteinA檢測蛋白表達量。實驗結果顯示共轉了PDHK3-shRNA的條件，第14 d的蛋白表達量提高了18.6%～233%，見圖1。表明抑制PDHK2基因，可以有效提高抗體蛋白表達量。

2.2 批次補料過程乳酸表達量

批次補料過程中，收集上清檢測乳酸含量的變化。實驗組的乳酸表達量在第5～14 d表現出較大差別，乳酸含量在批次補料過程中不斷降低，而對照組乳酸含量不斷增加（除第5個分子），見圖2。

2.3 PDHK3基因的mRNA表達水平

選取兩個比較有代表性的蛋白分子進行PDHK3基因的mRNA表達水平檢測。其中分子5是批次補料過程中唯一一個乳酸含量變化較小的分子，實驗組乳酸堆積雖然相對對照組后期的乳酸較低，但并未隨著時間的推移而逐漸降低。該分子的實驗組相對于對照組的PDHK3基因的mRNA表達水平降低了76%。分子7蛋白表達水平提高了233%，是蛋白表達提高百分比最高的分子。該分子的實驗組相對于對照組的PDHK3基因的mRNA表達水平降低了65%。通過實驗可知，抑制PDHK3基因的mRNA表達可以降低乳酸表達，同時可以提高目的蛋白產量。

2.4 Neomycin基因拷貝數檢測

4個分子（mAb1～mAb4）的實驗組和對照組2轉染的質粒中均含有Neomycin基因，拷貝數為4～9，見圖4。由拷貝數檢測實驗可知，PDHK3-shRNA在轉染過程及批次補料過程均有基因表達。

圖1 抗體相對表達量

圖2 乳酸表達量曲線

圖3 PDHK3基因的mRNA相對表達水平

圖4 Neomycin基因拷貝數

3 結論

將3個PDHK3-shRNA分別構建到WuXiBio載體中，這些混合質粒與表達不同蛋白的質粒分別共同轉染至宿主CHO細胞中。通過對Neomycin基因拷貝數檢測結果表明，構建的PDHK3-shRNA穩定轉染并整合到CHO細胞的基因組DNA中。而PDHK3基因的mRNA水平顯著降低且批次補料過程中乳酸含量降低，說明抑制PDHK3基因的表達可以降低乳酸含量。同時8個mAb實驗組的蛋白產量均得到提高，推測是由于細胞生長環境如pH得到改善，更有利于細胞表達目的蛋白。

綜上所述，本研究證明通過利用shRNA方法抑制PDHK3基因的表達，不僅可以降低乳酸表達量，同時能夠提高目的蛋白的表達量。