高效液相色譜法測定鹽酸法舒地爾中間體的含量

張亞梅，王國偉，劉璐

（1.天津天獅學(xué)院醫(yī)學(xué)院，天津 301700；2.天津柏海藥業(yè)有限責(zé)任公司，天津 301700）

鹽酸法舒地爾注射液是臨床上治療和改善蛛網(wǎng)膜下腔出血使用最多的一種藥。該藥最早在日本上市，由Asahi Kasei株式會社和Nagoya大學(xué)共同研制開發(fā)[1]。

國內(nèi)報(bào)道的鹽酸法舒地爾原料的合成思路，都是在日本專利的基礎(chǔ)上，對分離提純和溶劑稍加優(yōu)化，但是合成路線和日本專利基本一致[2-4]。以異喹啉為原料，與發(fā)煙硫酸反應(yīng)得到5-磺酸異喹啉（5-SI），再與SOCl2反應(yīng)得到5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽（5-CQH），再與高哌嗪反應(yīng)得到六氫-1-(5-異喹啉磺酰基)-1(H)-1,4-二氮雜卓，最后再鹽酸化、精制，制得目標(biāo)產(chǎn)物鹽酸法舒地爾。合成路線如圖1所示。

目前，法舒地爾原料及注射液是國內(nèi)仿制藥申請中非常熱門的品種，已經(jīng)在產(chǎn)和在銷的企業(yè)，競爭也是異常激烈[5]。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和市場競爭力，各企業(yè)都在提升內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。而提高鹽酸法舒地爾原料的純度，降低雜質(zhì)的種類和含量，對于提高注射劑質(zhì)量和安全性、降低臨床不良反應(yīng)是極其重要的環(huán)節(jié)。研究鹽酸法舒地爾合成過程中原料、各中間體的含量測定方法，以便對每個(gè)步驟的產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行把關(guān)，從而降低終端目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)，提高原料藥質(zhì)量和注射劑質(zhì)量及其安全性。

圖1 鹽酸法舒地爾合成路線

異喹啉作為起始原料，文獻(xiàn)有較多報(bào)導(dǎo)其含量檢測方法和方法學(xué)研究。引用專屬性較強(qiáng)的氣相色譜法[6]測定異喹啉含量對原料進(jìn)行把關(guān)，檢測方便快速。5-磺酸異喹啉是由異喹啉與20%發(fā)煙硫酸進(jìn)行磺化反應(yīng)而制得。且鹽酸法舒地爾注射液在運(yùn)輸和儲存過程中，如果保存條件不當(dāng)，也會降解生成5-SI，給質(zhì)量和安全性帶來很大隱患[7]。目前文獻(xiàn)中及各藥典均未見收載5-SI的含量檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；XS205DU電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國密理博公司。

5-SI對照品，批號DZ1205，含量≥99.9%；三乙胺、甲醇、磷酸均為色譜純，天津康科德科技有限公司；超純水，自制；5-SI樣品3批，市場采購。

5-CQH對照品，批號DL1301，含量≥99.9%；正己烷、異丙醇均為色譜純，天津科密歐試劑有限公司；超純水，自制；5-CQH樣品3批，市場采購。

1.2 波長的選擇

精密稱取5-SI對照品適量，加0.5%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)pH至7.0）-甲醇（60∶40）進(jìn)行溶解，并稀釋成濃度為 0.06 mg/mL 溶液，在 200～400 nm 區(qū)間內(nèi)進(jìn)行UV掃描。結(jié)果顯示，5-SI的最大吸收波長為272 nm，故選擇272 nm作為5-SI的檢測波長。

精密稱取5-CQH對照品適量，加正己烷-異丙醇（90∶10）進(jìn)行溶解，并稀釋成濃度為0.3 mg/mL的溶液，UV掃描測得最大吸收波長為279 nm，作為檢測波長。

1.3 色譜條件

5-SI檢測采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，流動相0.5%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0）-甲醇（60∶ 40），檢測波長 272 nm，流速 0.8 mL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

5-CQH檢測采用多糖涂敷型正相手性柱，流動相正己烷-異丙醇（90∶10）混合液，檢測波長279 nm，流速 1.0 mL/min，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

1.4 溶液的配制

1.4.1 供試品溶液的配制

精密稱取5-SI樣品30 mg至100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL至10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度；搖勻，即得供試品溶液。

精密稱取5-CQH樣品30 mg至100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得5-CQH供試品溶液。

1.4.2 對照品溶液的配制

精密稱取 5-SI對照品 30 mg 至 100 mL 容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液；精密量取2 mL至10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度；搖勻，即得對照品溶液。

精密稱取5-CQH對照品30 mg至100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得5-CQH對照品溶液。

1.5 檢測項(xiàng)目

對5-SI、5-CQH的檢測進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)、線性關(guān)系及定量限考察、精密度實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和影響因素實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-SI含量測定

2.1.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

儀器自動吸取空白流動相、加異喹啉流動相以及對照品溶液各20 μL，按照1.3色譜條件進(jìn)樣出圖。結(jié)果顯示，空白流動相、加異喹啉流動相均無干擾，對照品出峰時(shí)間為3.85 min左右，理論塔板數(shù)為10 488，符合要求。

2.1.2 線性關(guān)系及定量限考察

分別取1.4.2項(xiàng)下溶液對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 到 10 mL 容 量 瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得線性對照液1～5號，分別自動進(jìn)樣 20 μL，得方程：A=157 625C+101.01，線性系數(shù)為 0.999 8。

結(jié)果顯示該方法在濃度0.015～0.12 mg/mL的范圍內(nèi)，峰面積與對照液濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，符合要求。當(dāng)對3號對照液逐級稀釋，S/N≥3時(shí)，測得5-SI的最低檢出限為2.45 ng/mL。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)中，取3號溶液重復(fù)進(jìn)樣9次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.047%（n=9）。結(jié)果顯示，該方法精密度良好。

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn)

5-SI在對照品濃度80%、100%和120%三個(gè)濃度的加標(biāo)回收率在98.06%～101.68%，平均回收率99.76%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，符合要求。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對實(shí)際樣品進(jìn)行了放置 0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h的穩(wěn)定性試驗(yàn)，測得6份樣品含量的RSD為0.2%，證明5-SI水溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 影響因素實(shí)驗(yàn)

對5-SI進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)、高溫破壞、強(qiáng)酸破壞、強(qiáng)堿破壞等條件下的試驗(yàn)，觀察降解產(chǎn)物的出峰情況。專屬性試驗(yàn)，空白溶劑與5-SI對主成分峰無干擾。如圖2所示，對樣品進(jìn)行高溫破壞和強(qiáng)酸破壞，雜峰無增多，主峰峰面積無減小，且主成分峰與其雜質(zhì)峰分離良好；如圖3所示，對樣品進(jìn)行強(qiáng)堿破壞，在3 min之前的雜質(zhì)峰增多，且雜質(zhì)峰峰面積增大，但主成分峰與其雜質(zhì)峰分離良好，新產(chǎn)生的雜質(zhì)能夠通過此高效液相色譜方法檢測出來。

2.1.7 樣品含量的測定

精密稱取3批樣品，按照1.4.1方法配成溶液，測得樣品含量分別為98.7%、98.1%、99.8%，每批RSD均小于0.15%，均符合要求。

鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本方法適用于檢測鹽酸法舒地爾中間體5-SI的含量。

2.2 5-CQH含量測定

5-CQH是由5-SI與氯化亞砜進(jìn)行氯化反應(yīng)而制得。因5-CQH結(jié)構(gòu)的特殊性（遇水極易分解）[5]，故選擇正相系統(tǒng)進(jìn)行方法研究其含量測定方法。

2.2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按照1.3色譜條件進(jìn)樣出圖，結(jié)果顯示，空白溶劑對主成分峰無干擾。對照品出峰時(shí)間為14.2 min左右，理論塔板數(shù)符合要求。

2.2.2 線性關(guān)系及定量限考察

該方法在濃度0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與樣品中目標(biāo)化合物濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.998 9。當(dāng)S/N≥3時(shí)，測得最低檢出限為0.041 μg/mL。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)中，取0.3 mg/mL的5-CQH溶液重復(fù)進(jìn)樣9次，RSD為0.5%。證明該方法精密度良好。

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

5-CQH在對照品濃度的80%、100%和120%三個(gè)濃度的加標(biāo)回收率在98.05%～99.44%，平均回收率98.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，符合要求。

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用該方法對實(shí)際樣品進(jìn)行了放置0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 的穩(wěn)定性試驗(yàn)，測得 6 份樣品含量的RSD為0.5%，證明5-CQH在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 影響因素實(shí)驗(yàn)

因5-CQH遇水分解，本方法是在非水環(huán)境下進(jìn)行測定，不再進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿實(shí)驗(yàn)。本研究進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)、高溫破壞、光照實(shí)驗(yàn)等，觀察穩(wěn)定性情況。取化合物 5-CQH 3 mg置 100 mL 量瓶中，其溶液呈混懸液，不溶解于異丙醇，進(jìn)樣前用0.22 μm膜進(jìn)行過濾，可以除去5-磺酸異喹啉對本方法的干擾。將5-CQH放置在 50 ℃、100 ℃烘箱中分別加熱 5 h，50 ℃檢測含量沒有明顯變化，但是100 ℃加熱以后，已被破壞不再溶于異丙醇。將樣品放置在 1 000～1 500 Lx光照條件下照射8 h，按有關(guān)物質(zhì)色譜條件進(jìn)行測定。如圖4所示，為5-CQH光照試驗(yàn)結(jié)果，5-CQH光照后對主成分峰無破壞。

圖4 5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽光照試驗(yàn)

2.2.7 樣品含量的測定

精密稱取3批樣品，按照1.4.1方法配成溶液，測得樣品含量分別為97.5%、97.1%、97.4%，每批RSD均小于0.23%，均符合要求。

鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本方法適用于檢測鹽酸法舒地爾中間體5-磺酰氯異喹啉鹽酸鹽的含量。

3 結(jié)果與討論

（1）本試驗(yàn)研究了HPLC法測定鹽酸法舒地爾中間體5-SI的含量，通過對線性、定量限、精密度、穩(wěn)定性和回收率等項(xiàng)目的方法學(xué)研究，在0.015～0.120 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系（r=0.999 9）良好，回收率99.76%，RSD=0.76%。證明該方法可作5-SI含量測定用。

（2）本試驗(yàn)研究了HPLC法測定鹽酸法舒地爾中間體5-CQH的含量，通過對線性、定量限、精密度、穩(wěn)定性、回收率等項(xiàng)目的方法學(xué)研究，在0.1～0.6 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系（r=0.999 5）良好，回收率98.22%，RSD=0.90%。證明該方法可作5-CQH含量測定用。

（3）作為注射劑的原料藥，可以通過過程檢測其含量和雜質(zhì)，對終端產(chǎn)品鹽酸法舒地爾的純度起到非常重要的監(jiān)控作用。但是，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念，僅僅靠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制雜質(zhì)難度較大，更多的是基于產(chǎn)品性質(zhì)和過程監(jiān)控體系，所以要把持續(xù)改進(jìn)和提高監(jiān)控水平貫穿于整個(gè)產(chǎn)品生命周期中，才能保證患者用藥的安全性。