尹子葉，張圓媛，李穎，劉婧涵，高月瀅，劉琳，皮付偉

（江南大學，江蘇無錫 214000）

隨著納米技術的飛速發(fā)展，復雜三維結構的多枝狀金納米粒子已成為一種新型納米材料[1]。多枝狀金納米粒子具有獨特的物理化學性質如光學特性、生物親和性和較大的比表面積等[2]，其制備及應用方面的研究已成為材料領域研究的前沿課題。多枝狀金納米顆粒安全性高、穩(wěn)定性好、易于制備且具有獨特的電學效應、光學效應和磁學效應[3]，因此，在生物醫(yī)學領域具有極高的應用價值。國內外制備多枝狀金納米材料的方法主要包括兩種，分別是種子介導生長法和一步合成法。其中，種子介導生長法是目前運用最為普遍的方法，具有很好的可控性，但周期較長、操作復雜，吸附在材料表面的表面活性劑難以去除，容易對后續(xù)的應用造成影響。因此，通過實驗改良了種子介導生長法的缺點，極大地縮短其周期，在10 s內合成了無表面活性劑吸附的多枝狀金納米顆粒，命名為MSGNS。最新研究發(fā)現(xiàn)Anti-GPC3與金納米材料的結合能增強材料對HepG2細胞的遞送，這種以抗體搭建納米材料載體靶向癌癥細胞的研究思路，已被證實具有很好的實際應用性[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯金酸（HAuCl4，純度≥99%）、鹽酸（HCl）等無機試劑購自國藥控股化學試劑有限公司（中國上海）。PBS緩沖液和胰蛋白酶等購自碧云天生物技術有限公司（中國上海）。DMEM基礎試劑購自Thermo Fisher Scientific（美國）。Anti-Glypican 3 抗體 [9C2]購自Abcam（英國劍橋）。

VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司；Avaspec 2048紫外-可見分光光度計，荷蘭；JEM-2100透射式電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；THZ-D臺式恒溫振蕩器，上海百典儀器設備有限公司；EX-OHOUS電子天平，美國奧豪斯公司；Eppendorf離心機，德國艾本德公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MSGNS的合成

采用改進的Turkevich方法制備MSGNS。金種子液：攪拌條件下將 100 mL 的 0.75 mmol/L HAuCl4溶液在水浴下回流，之后添加2.19 mL的155.2 mmol/L檸檬酸三鈉溶液。待溶液變?yōu)樯罴t色后，繼續(xù)回流15 min，在4 ℃保存。在室溫25 ℃劇烈攪拌下將80 μL AgNO3（10 mmol/L）和200 μL抗壞血酸（0.1 mol/L），同時添加到含有 19.208 mL 超純水、0.4 mL HAuCl4（25 mmol/L）、40 μL HCl（1 mol/L）和 72 μL 金種子液的混合溶液中，10 s后溶液顏色由粉紅色變?yōu)樗{色。

1.2.2 MSGNS-GPC3的構建

將 2 mL 制備好的納米溶液與 6 mL Bicine 緩沖液混合，以 1 300 r/min 的速度攪拌，然后加入 20 mg固體粉末狀巰基聚乙二醇（Mercapto polyethylene glycol，SH-PEG），在25 ℃下以1 000 r/min的速度攪拌36 h。超純水離心洗滌 3 次（6 000 r/min，5 min），4 ℃保存。用蒸餾水將 Anti-GPC3（1 mg/mL）稀釋100倍，將其與MSGNS以1∶20體積比混合4 ℃孵育 12 h。8 000 r/min 離心 10 min，倒出上清液，原始濃度稀釋沉淀物得到MSGNS-GPC3。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

將凍存的細胞在37 ℃水浴條件下溶解，800 r/min離心5 min去掉凍存液，用5 mL完全培養(yǎng)基（胎牛血清FBS、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基DMEM體積比1∶9）重懸細胞，將相同濃度（100 μg/mL）的MSGNS-GPC3和MSGNS分別與HepG2細胞在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。

2 結果和討論

2.1 合成多枝狀金納米顆粒過程中不同時間點的表征

將合成MSGNS過程中出現(xiàn)在3個不同時間點（5 s、7 s、10 s）的溶液進行 TEM 和紫外測試，加入Vc和硝酸銀的時間點為0 s。如圖1和表1所示，5 s的溶液呈粉紅色且此時金納米顆粒呈球形，在580 nm處出現(xiàn)一個特征峰；7 s的溶液變成淺藍色，顆粒呈有觸角的球形，特征吸收峰遷移到1 030 nm；10 s時得到MSGNS溶液為深藍色，TEM清晰顯示多枝狀金納米顆粒的分枝。根據(jù)經典的Turkevich方法的機理，結合文獻[5]中觀察到的種子介導的金納米球向金納米六角形星的生長過程，可以得出結論，合成的MSGNS是通過Au原子各向異性而使得Au逐漸沉積在添加的種子上而合成。

圖1 合成多枝狀金納米顆粒過程中不同時間點的表征

2.2 金納米顆粒在不同狀態(tài)下的粒徑和分散度

MSGNS和改性后MSGNS的直徑大小（DIA）和分散性（PDI）見表1。如表1所示，MSGNS-GPC3的平均粒徑為（277.67±2.36）nm，遠大于MSGNSPEG的（212.68±2.61）nm和 MSGNS的（188.82±3.26）nm，PDI值均小于0.2，結果表明MSGNSGPC3構建成功且分散性良好。

表1 金納米顆粒在不同狀態(tài)下的粒徑和分散度

2.3 MSGNS-GPC3和MSGNS分別與HepG2細胞共同培養(yǎng)

將MSGNS-GPC3和MSGNS-PEG分別與HepG2細胞共同培養(yǎng)，如圖3所示。兩組細胞在0.5 h內沒有顯著差異。4 h后，少量MSGNS-PEG通過內吞作用存在于細胞體內，12 h后則大量聚集在細胞內部。相反，MSGNS-GPC3即使培養(yǎng)時間長達12 h，也不發(fā)生胞吞和聚集，而是被吸附在細胞膜上。結果表明，多枝狀金納米顆粒-GPC3可以在HepG2細胞膜上長時間共存。

圖3 MSGNS-PEG（d、e、f）和 MSGNS-GPC3（a、b、c）分別與HepG2細胞共培養(yǎng)的時間分辨光學圖

3 結論

本文合成了多枝狀金納米顆粒并分析其合成機理，將其與Anti-GPC3偶聯(lián)后發(fā)現(xiàn)其可以被吸附在HepG2細胞膜表面上且長時間與細胞共存。研究提供了合成多枝狀金納米材料的新方法，相比以前的方法其效率更高且不形成表面活性劑，有利于多枝狀金納米顆粒后續(xù)的修飾與應用，同時其細胞界面上的吸附性在癌細胞的診療方面具有很好的應用潛力。