復(fù)方DHA/PS/ASTA的功能及毒理學(xué)研究

劉振宇，岳喜軍

（1.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東濟(jì)南 250000；2.東平縣沙河站鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，山東泰安 271508）

目前，人口老齡化現(xiàn)象已成為世界各國(guó)共同面對(duì)的難題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上人口老齡化最嚴(yán)重的3個(gè)國(guó)家分別是日本、德國(guó)和意大利，老年人口的比重都在21%以上。我國(guó)人口老齡化的問(wèn)題亦日趨嚴(yán)重，從2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析來(lái)看，我國(guó)已有六省市進(jìn)入深度老齡化，這六個(gè)省市老齡化程度由高到低分別是遼寧省、上海市、山東省、四川省、重慶市和江蘇省，目前遼寧省65歲以上人口占比為15.17%，為全國(guó)最高。因此，關(guān)于中老年人的健康保健，任重而道遠(yuǎn)。

隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體免疫力逐漸降低、記憶力減退等癥狀是存在于中老年人群中的普遍現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了機(jī)體的正常功能。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理學(xué)研究表明，機(jī)體免疫力降低會(huì)嚴(yán)重加速機(jī)體的衰弱過(guò)程，降低其對(duì)疾病的抵抗能力，從而使機(jī)體易受外界環(huán)境的變化而患病；同樣，機(jī)體的記憶力減退，會(huì)致使機(jī)體逐漸發(fā)展至老年癡呆癥等嚴(yán)重癥狀。

因此，為了改變現(xiàn)狀，保護(hù)中老年人群的健康，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理學(xué)研究理論，現(xiàn)以二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）、磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）、蝦青素（Astaxanthin，ASTA）為原料制得復(fù)方ASTA制劑，其既能改善記憶又能增強(qiáng)免疫力。其中，原料PS、DHA均為國(guó)家批準(zhǔn)公布的新資源食品[1-2]，同被譽(yù)為新興的“智能營(yíng)養(yǎng)素”[3-6]，既能使細(xì)胞壁保持柔韌，同時(shí)能夠促進(jìn)增強(qiáng)傳送大腦信號(hào)的神經(jīng)遞質(zhì)的速率，從而達(dá)到促進(jìn)大腦快速高效運(yùn)轉(zhuǎn)的效果，激發(fā)機(jī)體大腦處于活化狀態(tài)，同時(shí)能增強(qiáng)免疫力。原料ASTA為類胡蘿卜素的一種，是一種較強(qiáng)的天然抗氧化劑[7]，能提高機(jī)體的免疫功能，同時(shí)能提高脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體T細(xì)胞功效的作用，刺激免疫球蛋白的產(chǎn)生，同時(shí)改善記憶力[8]。三者原料配伍，相輔相成，共同奏效。現(xiàn)對(duì)該復(fù)方制劑產(chǎn)品功能及安全性等方面進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)物試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 樣品

復(fù)方DHA/PS/ASTA糖果，0.5 g/粒（組方為：PS 0.10 g、DHA 0.15 g、ASTA 0.04 g，輔料 0.21 g）；每日2次，每次2粒。每人每日推薦量為2.0 g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物由山東大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供的健康SPF級(jí)昆明種雌、雄小鼠、Wistar大鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20130009。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（魯）20100011號(hào)。試驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)許可證SCXK（京）2014-0008。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級(jí)。試驗(yàn)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%±10%。

1.3 儀器設(shè)備

儀器設(shè)備、試驗(yàn)裝置均參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）[9]。

1.4 試驗(yàn)過(guò)程

1.4.1 改善記憶力功能動(dòng)物試驗(yàn)

1.4.1.1 跳臺(tái)試驗(yàn)

將雄性小鼠40只（體重25～32 g），隨機(jī)分為空白對(duì)照組和 0.17 g/kg.bw、0.33 g/kg.bw、0.66 g/kg.bw三個(gè)受試物劑量組，每組10只，受試物劑量分別相當(dāng)于人體每日推薦量的5倍、10倍、20倍，三個(gè)劑量組每天灌胃給予受試物，連續(xù)給樣30 d后，進(jìn)行跳臺(tái)訓(xùn)練試驗(yàn)。將各組小鼠撫摸幾下后放入小鼠跳臺(tái)測(cè)試箱中，讓其適應(yīng)30 min。調(diào)節(jié)電壓為32 V，開(kāi)始試驗(yàn)，對(duì)小鼠進(jìn)行電刺激，在訓(xùn)練期間通電小鼠跳下平臺(tái)在箱底不斷被電擊，這個(gè)過(guò)程中小鼠獲得記憶。24 h后檢測(cè)其記憶力，重復(fù)前操作，此時(shí)測(cè)試儀記錄小鼠第一下跳下平臺(tái)的時(shí)間即潛伏期和5 min內(nèi)跳下平臺(tái)的次數(shù)即測(cè)試期的錯(cuò)誤次數(shù)，作為記憶保持成績(jī)。

1.4.1.2 水迷宮測(cè)試試驗(yàn)

動(dòng)物選擇、試驗(yàn)分組以及受試物劑量、途徑、時(shí)間均同跳臺(tái)試驗(yàn)一樣。給受試物30 d后開(kāi)始進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，訓(xùn)練期間繼續(xù)給予受試物，每天訓(xùn)練1次，連續(xù)5 d，第1 d訓(xùn)練前將小鼠放在梯子附近，使其自動(dòng)爬上3次，以后每次訓(xùn)練前將小鼠放在梯子附近，使其自動(dòng)爬上1次。第1 d訓(xùn)練時(shí)，用擋板在A處擋住，進(jìn)行訓(xùn)練。第2 d從B處開(kāi)始，此路程訓(xùn)練3次，80%的動(dòng)物到期達(dá)終點(diǎn)。第5 d從起點(diǎn)S開(kāi)始訓(xùn)練，最后以5 d的總學(xué)習(xí)成績(jī)進(jìn)行評(píng)價(jià)（即各組2 min內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)、每組5 d平均錯(cuò)誤次數(shù)和到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間）。

1.4.2 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

將體重25～32 g的小鼠80只，雌雄各半，分為2個(gè)免疫大組，每大組40只，每免疫大組小鼠分為正常對(duì)照組、0.17 g/kg.bw、0.33 g/kg.bw、0.66 g/kg.bw 三個(gè)受試物低、中、高劑量組，劑量分別相當(dāng)于人體每日推薦量的5倍、10倍、20倍。免疫一組（雌）用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）試驗(yàn)、血清溶血素的測(cè)定、抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定；免疫二組（雄）用于小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。具體試驗(yàn)操作參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）[9]。

1.4.3 毒理學(xué)試驗(yàn)

1.4.3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受劑量法試驗(yàn)，選用體重為25～32 g的小鼠20只，雌雄各半。小鼠灌胃前16 h禁食，自由飲水，于第2 d 以 15.0 g/kg灌胃后，連續(xù)觀察14 d，記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。

1.4.3.2 遺傳毒性試驗(yàn)

（1）污染物致突變性檢測(cè)（Ames試驗(yàn)）：采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四種標(biāo)準(zhǔn)突變型試驗(yàn)菌株。大鼠肝勻漿S-9采用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)Wistar大鼠，按Ames常規(guī)方法自行制備。劑量組分設(shè)5 000μg/皿、1 000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿和8 μg/皿5個(gè)劑量組，設(shè)自發(fā)回變、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組，每種菌株每個(gè)測(cè)試濃度設(shè)3個(gè)平皿，在加和不加S-9條件下進(jìn)行試驗(yàn)。37 ℃培養(yǎng) 48 h，記錄回復(fù)突變菌落數(shù)。

（2）小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核試驗(yàn)：50只小鼠（雌雄各半，體重25～32 g）隨機(jī)分成5組，設(shè) 2.5 g/kg.bw、5.0 g/kg.bw 和 10.0 g/kg.bw 三個(gè)不同劑量組，1個(gè)環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組（40 mg/kg.bw）和1個(gè)純化水陰性對(duì)照組。小鼠按0.02 mL/kg體重灌胃容量，間隔24 h灌胃2次，于末次灌胃后6 h處死動(dòng)物，制取胸骨髓液，涂片，甲醇固定，染色。鏡檢PCE，每鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核千分率，以%表示；同時(shí)計(jì)數(shù)PCE和正染紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）。

（3）小鼠精子畸形試驗(yàn)：50只雄性小鼠（體重25～32 g）隨機(jī)分成 5 組，每組 10 只。設(shè) 2.5 g/kg.bw、5.0 g/kg.bw和10.0 g/kg.bw三個(gè)不同劑量組，另設(shè)植物油陰性對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組，受試物按0.02 mL/g體重灌胃容量以灌胃方式給予，連續(xù)5 d，繼之飼養(yǎng)1月，自由攝食、飲水，于35 d頸椎脫臼處死，常規(guī)制片，記錄畸形精子數(shù)，計(jì)算精子畸形率。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)方差齊者采用t檢驗(yàn)；如數(shù)據(jù)方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。應(yīng)用軟件為 SPSSI 1.5 及 SPSSI 6.0 for Windows。

2 結(jié)果與分析

2.1 改善記憶力動(dòng)物試驗(yàn)

2.1.1 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，跳臺(tái)試驗(yàn)中，經(jīng)口給予小鼠不同受試物劑量的受試物30 d，記憶獲得（訓(xùn)練）過(guò)程中，與正常對(duì)照組相比，受試物中、高劑量組的平均錯(cuò)誤次數(shù)均顯著減少（P＜0.05）；重復(fù)測(cè)驗(yàn)過(guò)程中，與正常對(duì)照組相比，受試物高劑量組跳下平臺(tái)的潛伏期延長(zhǎng)，平均錯(cuò)誤次數(shù)減少，錯(cuò)誤反應(yīng)率顯著降低（P＜0.05）。

2.1.2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，水迷宮試驗(yàn)中，給予小鼠不同劑量的受試物30 d，與正常對(duì)照組比較，各受試物劑量組動(dòng)物到達(dá)終點(diǎn)所需的時(shí)間顯著縮短（P＜0.05）；平均錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)顯著多（P＜0.05）。

2.2 免疫試驗(yàn)

2.2.1 對(duì)小鼠體重和臟器體重比值的影響

正常對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組初始體重的方差分析結(jié)果顯示，在各組間小鼠的初始體重較為均衡，各組均數(shù)間差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。給予小鼠不同劑量的受試物制劑30 d，正常對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組體重增長(zhǎng)值的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性（P＞0.05），即該受試物對(duì)小鼠體重?zé)o影響；脾臟體重比值和胸腺體重比值的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性（P＞0.05），即受試物對(duì)小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值均無(wú)影響。

2.2.2 受試物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

由表3正常對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組的小鼠足跖腫脹度的方差分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，中、高劑量受試物組間有顯著性差異（P＜0.05），由此可知該受試物有提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的能力；淋巴細(xì)胞增殖能力的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明該受試物細(xì)胞免疫試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

表1 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果

表2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

表3 受試物對(duì)小鼠免疫功能的影響

與正常對(duì)照組相比，受試物組有顯著提高小鼠抗體細(xì)胞生成數(shù)的能力（P＜0.05）；抗體積數(shù)的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），尚不能認(rèn)為受試物有提高小鼠血清溶血素水平的能力。由此顯示，體液免疫試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.3 毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)中，14 d試驗(yàn)期內(nèi)未見(jiàn)動(dòng)物明顯中毒癥狀和死亡情況。最大耐受量（MTD）法試驗(yàn)結(jié)果顯示，該受試物對(duì)兩種性別小鼠的MTD均＞15.0 g/kg.bw。因此，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該受試物屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。

2.3.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.3.2.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100和TA102四株試驗(yàn)菌株，在加與不加S-9時(shí)，回變菌落數(shù)均未超過(guò)溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍。因此，Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組微核率與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量組微核率與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，小鼠骨髓PCE微核試驗(yàn)結(jié)果陰性。

2.3.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組小鼠精子畸形率為6.23%，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果陰性。

3 結(jié)論

在改善記憶力動(dòng)物試驗(yàn)中，跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)的試驗(yàn)組動(dòng)物記憶獲得的錯(cuò)誤反應(yīng)潛伏期延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)、錯(cuò)誤反應(yīng)率降低，與對(duì)照組比較，差異具顯著性；水迷宮試驗(yàn)組動(dòng)物到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間縮短，到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)增加，錯(cuò)誤次數(shù)減少，與對(duì)照組比較，差異亦具顯著性，且訓(xùn)練及重復(fù)測(cè)驗(yàn)結(jié)果一致。由此表明復(fù)方DHA/PS/ASTA糖果制劑具有改善記憶的作用。

增強(qiáng)免疫動(dòng)物試驗(yàn)中，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的受試物30 d，對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)不良影響，對(duì)小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無(wú)影響，小鼠的體液免疫功能、細(xì)胞免疫功能測(cè)定結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)果表明，復(fù)方DHA/PS/ASTA糖果制劑具有增強(qiáng)免疫力的作用。

毒理學(xué)試驗(yàn)中，經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)兩階段毒理試驗(yàn)結(jié)果，可知本品屬無(wú)毒級(jí)，無(wú)遺傳毒性作用，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響，其最大未觀察到有害作用劑量大于人體可能攝入量的100倍，由此證明具有安全性，且同時(shí)證明DHA、PS、ASTA三者原料配伍具有安全性。