高效降解長鏈烷烴微生物菌株的分離鑒定與降解特性

崔倩倩，劉朝陽

（1.中冶華天工程技術有限公司，江蘇南京 210019；2.中國科學院南京土壤研究所，江蘇南京 210008）

隨著石油工業(yè)的發(fā)展，石油污染問題越來越引起人們的關注。據(jù)估計，全世界每年約有1×109t石油及其產(chǎn)品進入地下水、地表水及土壤中，對自然環(huán)境、人體健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面造成了嚴重影響。石油是由多種烴類和非烴類組成的復雜混合物，烷烴作為石油的重要成分，占石油中含量的50%～95%[1]。已有的研究報道表明，長鏈烷烴結構穩(wěn)定，不易自然降解，大量存在被石油污染的環(huán)境中[2-3]。而原油中的飽和烴，特別是中間長度的烷烴（C10～C20）更容易被生物降解。烷烴是石油中含量最多的成分，正十六烷烴是烷烴中的一種重要成分，水溶性低、難揮發(fā)，一旦進入環(huán)境就很難被消除，屬于持久性污染物[4]。

利用物理、化學方法處理石油烴可以得到較好的效果，但因造價高、二次污染等問題，其應用受到了限制[5]。相比物理和化學處理方法，生物處理方法具有很大的優(yōu)勢，微生物能夠通過生物降解方式處理含油成分，具有處理效果好、 費用低、對環(huán)境影響小及應用范圍廣等優(yōu)點。可以降解石油污染物的微生物種類繁多，可利用多種微生物混用來降解不同烷烴，但在實際應用中存在不同菌株適用條件不一致、菌群穩(wěn)定性差等問題，應用受到限制，因此篩選得到一株高效的烷烴降解菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

酵母浸出粉，OXOID LP0021生物試劑；蛋白胨，北京奧博星生物試劑；NaCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂，國藥集團化學試劑有限公司；正十六烷 烴，色 譜 純，Sigma-Aldrich；TransStart FastPfu DNA聚合酶，北京全式金生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Omega公司；DNA ladder，Thermo公司。

DR5000紫外可見光分光光度計，哈希；GC-2010 Pro氣相色譜，日本島津；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；LP5200P電子天平，德國Sartorius；MLS-3750全自動高壓滅菌器，日本SANYO；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，蘇州江東精密儀器有限公司；THZ-300C型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司。

1.2 樣品采集

試驗中用于篩選高效石油烴降解菌株的土壤樣品采自東營勝利油田采油廠附近被原油重度污染的土壤。用以配制富集培養(yǎng)基的原油采自東營勝利油田采油廠原油。用以測定石油烴降解效果的廢水取自某汽車生產(chǎn)廠內(nèi)的含汽油、柴油廢水。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：原油1 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 為 7.2～7.4。

無機鹽培養(yǎng)基：酵母粉 3 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 為 7.2～7.4。

分離培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 為 7.0。

1.4 烷烴降解菌的富集分離

稱取10 g受原油污染的土壤加入到富集培養(yǎng)基中，置于 30 ℃、150 r/min的搖床培養(yǎng) 7 d，然后取2 mL培養(yǎng)液到新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，取富集培養(yǎng)液1 mL，用無菌水按照體積比稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的菌懸液，取100 μL稀釋好的濃度梯度的菌懸液均勻地涂布在固體LB平板上，倒置放于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待長出單菌落后挑取形態(tài)差異較大的單菌落劃線分離，挑取劃線后單菌落菌株，LB斜面保存于4 ℃中。

1.5 烷烴降解菌的篩選

將挑取出來的單菌落活化，按1%比例轉(zhuǎn)接到含正十六烷烴的無機鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，測定菌株的OD600（菌液在 600 nm波長處的吸光度），選取生長狀況較好的菌株作為初篩菌株，通過氣相色譜測試初篩菌株對正十六烷烴的降解率，確定復篩菌株，得到對正十六烷烴降解率最高的菌株。

上述方法的測試方法為：正十六烷的萃取使用液-液萃取技術，用正己烷作萃取劑，用氣相色譜火焰電離檢測器（GC-FID）分析正十六烷的含量。具體操作方法如下：（1）將5 mL的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，在培養(yǎng)液中加入2 mL色譜純正己烷，劇烈攪拌2 min，將此混合液倒入分液漏斗中反復振蕩，靜置分層，吸取上層有機相至10 mL容量瓶中，按以上步驟重復萃取2次。合并萃取液在5 000 r/min下離心10 min，收集上層清液，用正己烷定容至25 mL，之后液體通過0.22 μm聚四氟乙烯過濾器。

GC-FID的測定條件為：AHP-5MS柱（Agilent，USA）（5%苯基柱，95%甲基硅；長30 m×直徑0.025 mm× 膜厚度 0.25 μm）在 120 ℃下保持 1 min，以 20 ℃ /min 增加到 180 ℃，在 180 ℃下保持 5 min。氮氣作為載流氣體，控制流速恒定為1.5 mL/min。注射器和檢測器的溫度分別為250 ℃和270 ℃，注射體積為 2 μL。

1.6 烷烴降解菌的菌株鑒定

將篩選到的對正十六烷烴降解率最高的菌株離心收集菌體，采用細菌提取試劑盒提取細菌基因組DNA，并采用正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ）和反向引物 1492R（5'-CGGGCGGTGTGTACAAG-3' ）進行PCR擴增，回收擴增的片段送至美吉生物進行測序。將測得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中經(jīng)NCBI Blast檢索比對，確定菌株種屬。

1.7 烷烴降解菌的乳化能力

表面活性劑是烴類降解的主要影響因素，表面活性劑能增強有機物的親水性，使生物降解速度得到很大程度的提高。乳化力測定：將培養(yǎng)液離心（9 000 r/min，4 ℃，20 min），取 2 mL 上清液加入 2 mL 正十六烷烴振蕩5 min，觀察分層液面的高度。

2 結果與分析

2.1 可降解長鏈烷烴微生物的富集分離結果

取在富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布分離平板，如圖1所示，分離挑取12株具有不同形態(tài)的單菌落菌株進行劃線分離。將其劃線得到純化的菌株，LB斜面劃線，4 ℃保存。

2.2 可降解長鏈烷烴微生物的篩選

將純化后的單菌落活化，接種于含0.1%正十六烷烴的5 mL無機鹽培養(yǎng)基試管中，將其放置于30 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，目測菌株P3、P7、P12菌液濁度較大，其他菌株培養(yǎng)液濁度較小。用分光光度計測定菌株的OD600，結果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)菌株P3、P7、P12生長狀況較好，其中菌株P7的OD600最大，說明三株菌株可以以烷烴為唯一碳源生長。選取P3、P7、P12為初篩菌株，采用氣相色譜法檢測菌株對烷烴的降解率，確定P12為降解性能最好的菌株，如圖3所示降解率達到74.8%。

圖1 分離挑選的12株單菌落

圖2 以正十六烷烴為唯一碳源的不同菌株的OD600

圖3 初篩菌株對正十六烷烴降解率

2.3 菌種的鑒定

取P12菌株5 mL送上海美吉生物有限公司測序，測序結果 16S rDNA 基因序列長 2 065 bp，經(jīng)GenBank中Blast檢索比對，該菌株P12與Acinetobacter junii的相似度達99%，確定菌株P12為瓊氏不動桿菌屬（Acinetobacter junii），命名為Acinetobacter juniiP12。于2019年5月30日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（簡稱CGMCC），地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，其保藏號為 CGMCC NO.17873。

2.4 菌株乳化能力測試

如圖4所示，加入P12菌株上清液的正十六烷烴液面下降，有乳化現(xiàn)象產(chǎn)生。生物乳化劑屬于表面活性物質(zhì)，分子由疏水和親水兩部分構成，同時具有親脂和親水的性質(zhì)，因此可增加油水的接觸面積，從而促進微生物對石油類污染物的降解效果。

圖4 P12菌株的生物乳化作用

2.5 菌株的最適降解條件

2.5.1 最適降解溫度

將菌株Acinetobacter juniiP12接種到含有體積比為0.1%的無機鹽培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min和培養(yǎng)溫度分別為 15 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)48 h，采用氣相色譜法檢測溫度對菌株降解正十六烷烴的影響，結果見圖5。由結果可以看出，菌株最適宜溫度為30 ℃。溫度直接影響酶的活性，而微生物作用于烴類主要依靠酶催化反應對其進行降解。該菌株適宜溫度范圍為25～40 ℃，具有較廣的溫度利用范圍。

圖5 Acinetobacter junii P12在不同溫度下對正十六烷烴的降解曲線

2.5.2 最適降解pH

將P12接種到含正十六烷烴體積比為0.1%濃度的無機鹽培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)pH為3、5、7、9、11，在轉(zhuǎn)速為 150 r/min 和溫度為 30 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)48 h，采用氣相色譜檢測pH對菌株Acinetobacter juniiP12降解正十六烷烴的影響，結果見圖6。pH值為6～8，菌株對正十六烷烴都具有較好的降解率，可在此范圍內(nèi)廣泛應用，其中在pH為7的條件下降解效果最好。

圖6 Acinetobacter junii P12在不同pH下對正十六烷烴的降解曲線

2.5.3 菌株對含石油烴廢水的處理

將取自汽車生產(chǎn)廠內(nèi)的含汽油、柴油的廢水，用該廢水配制無機鹽培養(yǎng)基，將菌株活化培養(yǎng)的C12菌株轉(zhuǎn)接到該無機鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)7 d。同時設置對照組，用該廢水配制無機鹽培養(yǎng)基，不接菌，其余與實驗組條件一致，分別對比兩組中石油烴的含量。結果顯示加入該降解菌可降解總石油烴的54%，說明該菌株對正十六烷烴不具專一性，也可以降解其他的烴類物質(zhì)，在石油烴污染的水體中具有很好的應用潛力。

3 結論與展望

本研究獲得的瓊氏不動桿菌Acinetobacter juniiP12篩選自受石油污染的土壤中，因此該菌株進入石油污染的環(huán)境中能很快成為優(yōu)勢菌群，有效促進烷烴的降解，對污染修復具有很重要的作用。同時，該菌株是以單一菌株實現(xiàn)對烷烴的高效率降解，減少了混合菌株制備過程中不同菌株單獨培養(yǎng)、分別活化、按比例混合等復雜操作步驟，方便應用，并且應用條件較好控制。此外，該菌株產(chǎn)生的生物乳化作用將提高烴類污染物在水中的溶解度，更有利于水體和土壤中石油類污染物的治理和生物修復。對于成分更復雜的原油物質(zhì)，如果嘗試將該菌株與其他優(yōu)勢菌株建立混合菌群，可通過菌群之間的協(xié)同作用，嘗試解決對其他烷烴降解效果不足的問題，更有利于環(huán)境的治理[6-7]。在以后的研究中可以加強對極端環(huán)境下降解菌的研究，同時加強與分子生物學、物理化學等交叉學科融合創(chuàng)新，加強石油污染的聯(lián)合修復和積極推廣。