體外培育熊膽粉對小鼠中樞神經系統作用的一般藥理學研究

陸錦遙，王瓊，王優杰，谷穎敏，章鑫，謝家駿，張小利，田雪松*

(1.上海中醫藥大學創新中藥研究院，上海 201203；2.上海凱寶藥業股份有限公司，上海 201401)

熊膽是傳統名貴中藥，熊膽粉為熊科動物黑熊(Selenaretos thibetanus Cuvier)經膽囊手術引流膽汁而得的干燥品，具有清熱、平肝、明目等功效，用于治療驚風抽搐，目赤腫痛，咽喉腫痛[1-3]。限于天然熊膽粉來源的特殊性和稀缺性，其相關中藥制劑的開發和使用受到了嚴重阻礙，因此通過合成或生物技術的手段尋找安全有效的熊膽粉替代品迫在眉睫[4-5]。上海中醫藥大學、上海凱寶藥業股份有限公司及重慶大學協作建立了熊膽粉體外培育生物轉化技術，將家禽雞膽粉體外轉化為熊膽粉，以期替代天然熊膽粉應用于臨床。為進一步探究基于該技術生產的體外培育熊膽粉的安全性，本實驗按照《中藥、天然藥物一般藥理學研究技術指導原則》對其進行一般藥理學研究，觀察其對小鼠中樞神經系統的影響，為臨床應用提供安全性評價實驗數據，并為進一步研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 ICR小鼠160 只，雌雄各半，體質量16～18 g，SPF 級，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物合格證號:SCXK (滬) 2013-0016。所有動物均飼養于上海中醫藥大學SPF 級動物房，環境溫度23～24 ℃，相對濕度42%～63%，換氣次數≥15次/h。人工控制照明，晝夜交替時間為12 h/12 h。所有動物實驗嚴格遵守上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會的要求。

1.1.2 藥物與試劑 體外培育熊膽粉(上海凱寶藥業股份有限公司，黃色至深棕色碎片、顆粒或粉末，含量：牛磺熊去氧膽酸31.1%，牛磺鵝去氧膽酸13.3%，批號：20160801)，臨用時，0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解配置成所需濃度的溶液；地西泮(上海信誼藥廠有限公司，規格：2.5 mg/片，批號：1416030)。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司，微黃色纖維狀粉末，批號：20150421)，用前配制成0.5% (W/V)溶液。戊巴比妥鈉(德國進口分裝，白色粉末，純度：≥98%，批號：WS20141110)。上述藥品均密封，避光，置陰涼干燥處保存。

1.1.3 主要儀器 ME203型電子天平(儀器編號：20131673，梅特勒-托利多有限公司)；YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(儀器編號：20020620、20061560，濟南益延科技發展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠一般行為和自發活動實驗 取檢疫合格的小鼠60 只，按給藥前自發活動數隨機分為5 組，每組12只，雌雄各半，分別為溶劑對照組、體外培育熊膽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組。低、中、高劑量組分別灌胃體外培育熊膽粉為0.8、2.5、8.0 g·kg-1；陽性對照組灌胃地西泮2.0 mg·kg-1；溶劑對照組灌胃等容量20 mL·kg-1的0.5% CMC-Na溶液。給藥前各組禁食3～5 h，觀察給藥后2.5 h內的一般行為變化(姿態、步態、流涎、流汗、肌顫及瞳孔變化等)。多功能小鼠自主活動記錄儀記錄給藥前及給藥后30、60、90、120及150 min小鼠的自發活動次數。每次記錄前先將小鼠置于自主活動儀中適應3 min，記錄5 min 內小鼠的自發活動次數。

1.2.2 小鼠協調運動實驗 給藥前兩天，每天用一根表面光滑、垂直豎立的金屬棒(直徑為1.5 cm，長度80.0 cm)，訓練小鼠爬竿，每天3次。給藥當天，按協調運動障礙評級標準(見表1)，挑取檢疫合格且評分0.0級小鼠50 只，體質量隨機分為5 組，每組10只，雌雄各半，分別為溶劑對照組、體外培育熊膽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組(除給予陽性對照組地西泮3.0 mg·kg-1外，其他給藥方法與劑量同自發活動實驗)。給藥前各組禁食3～5 h，分別于給藥前及給藥后30、60、90、120及150 min將小鼠頭朝下放在棒的頂端，任小鼠自然向下爬行，以測定協調運動情況。

表1 協調運動障礙評級標準

1.2.3 閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉協同作用實驗[6]取檢疫合格的小鼠50 只，按體質量隨機分為5 組，每組10只，雌雄各半，分別為溶劑對照組、體外培育熊膽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組(給藥方法與劑量同小鼠協調運動實驗)。給藥前各組禁食3～5 h，給予溶劑及體外培育熊膽粉后60 min(陽性對照組灌胃3.0 mg·kg-1地西泮后30 min)，小鼠腹腔立即注射戊巴比妥鈉30 mg·kg-1，以翻正反射消失達1 min以上者計為發生睡眠，計算各組睡眠發生百分率。

2 結果

2.1 體外培育熊膽粉對小鼠一般行為和自發活動的影響 各劑量組的體外培育熊膽粉對小鼠姿態、步態、流涎、流汗、肌顫及瞳孔變化等一般行為無明顯影響。在自發活動方面，低劑量、高劑量組與溶劑對照組在各時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)。中劑量組給藥后60 min自發活動減少，與溶劑對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，其余時間點相比差異無統計學意義(P>0.05)。陽性對照組給藥后各時間點小鼠活動均減少，與溶劑對照組相比差異均有統計學意義(P<0.001)，結果見表2。

表2 體外培育熊膽粉對小鼠自發活動的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05，**P<0.001

2.2 體外培育熊膽粉對小鼠協調運動的影響 各劑量組給藥后各時間點與溶劑對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠協調運動障礙的評級明顯升高，在給藥后各時間點差異均有統計學意義(P<0.001)，結果見表3。

表3 體外培育熊膽粉對小鼠協調運動的影響(n=10)

注：與溶劑對照組比較，**P<0.001

2.3 體外培育熊膽粉對閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉協同作用的影響 溶劑對照組(無小鼠睡眠)、低劑量(無小鼠睡眠)、中劑量[10只小鼠1只(雌性)睡眠]、高劑量[10只小鼠1只(雄性)睡眠]，睡眠發生的百分率與溶劑對照組相比，無統計學意義(P>0.05)。給予陽性對照品30 min時，腹腔注射閾下睡眠劑量的戊巴比妥鈉，小鼠全部睡眠(5雌性,5雄性)，睡眠發生的百分率與溶劑對照組相比有統計學意義(P<0.001)，結果見表4。

表4 體外培育熊膽粉與閾下睡眠劑量的戊巴比妥鈉協同作用對小鼠睡眠的影響(n=10)

注：與溶劑對照組比較，**P<0.001

3 討論

體外培育熊膽粉擬臨床用于替代天然熊膽粉，但是其對中樞神經系統的影響尚未進行研究，其臨床安全性及潛在受累器官均不清楚。前期實驗顯示，體外培育熊膽粉大鼠藥效學有效劑量為0.3 mg·kg-1，按照安全藥理學試驗的劑量設定原則“應包括或超過主要藥效學的有效劑量或治療范圍”，故本次實驗低劑量設定為0.8 g·kg-1，中、高劑量分別按等比設定為2.5和8.0 g·kg-1[7]。此外文獻報道，大鼠灌胃熊膽粉提取物后，熊去氧膽酸Tmax為(55.0±7.7)min，t1/2為(97.5±17.7)min，鵝去氧膽酸Tmax為(52.5±8.2)min，t1/2為(113.8±21.5)min。故本次實驗記錄給藥后30、60、90、120及150 min，涵蓋了體外培育熊膽粉主要組分的Tmax及t1/2[8]。

本實驗結果顯示，各劑量組的體外培育熊膽粉對小鼠一般行為無明顯影響，但在自發活動方面，低、高劑量組與溶劑對照組相比差異無統計學意義；中劑量組在給藥后60 min自發活動減少，其余各時間點均差異無統計學意義，因該時間點一般行為無明顯改變，協調運動亦差異無統計學意義，且高劑量組無類似改變，故認為此變化與藥物毒性作用無關；陽性對照組給藥后各時間點自發活動均減少，差異有統計學意義。在協調運動實驗，低、中及高劑量的體外培育熊膽粉在各時間點對小鼠協調運動無明顯影響，陽性對照組與溶劑對照組相比在各時間點差異均有統計學意義。在閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉實驗，低劑量組無睡眠出現，中、高劑

量組各有1只睡眠，但無統計學差異；陽性對照組則全部睡眠，與溶劑對照組相比差異均有統計學意義，表明具有協同作用。

綜合考慮認為，小鼠灌胃設計劑量的體外培育熊膽粉對中樞神經系統無明顯影響。本實驗進一步補充和完善了體外培育熊膽粉安全性實驗數據，為其在臨床上的應用提供了實驗依據。