經唑來膦酸處理的羥基磷灰石對兔脛骨骨缺損的治療效果

張志鵬 孫海濱 黃麗麗 劉軍華 秦凱強 薛志剛 張宏濤

（1.昌樂縣人民醫院，山東濰坊 262400；2.濰坊市中醫院，山東濰坊 261041）

骨折的愈合是指骨折斷端間的組織修復過程，最終恢復骨骼的正常結構與功能。然而，盡管骨科器械不斷地發展，骨折缺損仍是困擾骨科大夫的一大難題，骨折不愈合的現象仍然存在。尤其是骨折斷端存在明顯缺損，不得不通過植入自體骨或者人工骨來填充。迄今為止，自體骨移植都被認為是治療骨缺損的金標準，然自身骨髂取骨區存在諸多并發癥。外源性生物因子rhBMP_2的生物活性效果理想，價格昂貴，在臨床上大量推廣是不現實的。

唑來膦酸是含雙氮雙膦酸類藥物，具有非常強的抗骨吸收的能力，可以不同程度抑制破骨細胞的活性，或者減少破骨細胞的數量，最終做到減少骨的丟失，相關研究表明低濃度唑來膦酸長時間局部應用于骨折斷端可明顯促進骨折愈合的速度[1]，但唑來膦酸對人工骨應用于粉碎性骨缺損區的作用鮮有報道。本實驗探討唑來膦酸與人工骨結合對骨缺損區愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

25只6～8月齡雄性新西蘭大白兔（清潔級，合格證號：SCXK（魯）2016 0002）體質量 3～ 4 kg，平均體質量（3.5±0.33） kg，將所有兔左后腿標記為實驗組，所有兔的右后腿標記為對照組。實驗動物經濰坊醫學院動物倫理委員會同意，主要實驗藥物唑來膦酸注射液為中國正大天晴公司生產，批號為國藥準字20041246。

1.2 實驗模型的制備

實驗動物麻醉完成后，將固定好的左后肢取中段，應用骨刀及咬骨鉗取大小約1 cm×2 cm的骨骼，造成骨缺損區，然后將預先配置好的10-9mol/L的唑來膦酸液浸泡羥基磷灰石人工骨，浸泡10 min后植入骨缺損區，經浸泡過的明膠海綿置入骨缺損區表面，應用可吸收線捆綁，包扎后應用高分子石膏制成夾板固定。術后給予肌注慶大霉素1支，預防感染。同法處理新西蘭大白兔的右腿，區別于實驗組的是應用生理鹽水浸泡羥基磷灰石及明膠海綿。

1.3 觀察指標及檢測方法

（1）影像學指標：術后第10周應用大型X線機觀察實驗組及對照組骨缺損區的愈合情況。

（2）組織學觀察：分別在術后第4、6周麻醉處死1只兔子，實驗兔左右兩側骨缺損區取人工骨與自身骨骼交界處的骨組織，切片，并進行HE染色，并應用高倍顯微鏡觀察，比較2者的差異。

HE 染色步驟：

①取石蠟切片依次放置于二甲苯和濃度梯度乙醇中脫蠟并水化。

②移至蘇木素染色 5 min，流水去蘇木素液 3 s。

③1%鹽酸乙醇 3 min，流水 3 s。

④0.5%伊紅溶液3min，流水促細胞核返藍30min。

⑤濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂蓋玻片封片。

⑥應用顯微鏡觀察。

（3）骨密度情況：分別取術后第2、4、6周骨折缺損區人工骨與自身骨骼交界處的骨組織，并進行骨密度測定，比較2者的差異。

1.4 統計學分析

應用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0. 05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨折缺損模型的制備

在實驗操作中有1只新西蘭大白兔因麻醉過量致死，及時給予補充，1只在第3周時因感染死亡。其余新西蘭大白兔均在預定的設想下進行，無明顯特殊情況發生。

2.2 影像學檢查結果

圖1 實驗組10周情況

圖2 對照組10周情況

通過影像學檢查可明顯看出實驗組較對照組骨密度明顯增加，骨小梁更為密集，排列更規則，骨缺損區成高密度表現，而對照組則骨質明顯疏松，骨缺損區密度較實驗組明顯減低。

2.3 HE染色結果

在第4、6周實驗組骨小梁均較對照組明顯增多。

根據HE染色結果可明顯看出在術后第6周對照組的骨小梁較纖細，且數量較少，散在分布，周圍成骨細胞數量較少；然而實驗組有大量新生骨小梁，粗壯且數量較多，并且可觀察到大量的成骨細胞，少量的炎性細胞。術后10周，對照組骨小梁數目較6周時明顯增多，且明顯粗壯、密集，但新生骨量較實驗組少，成骨細胞數量較多；實驗組骨折區新生骨小梁數目較術后6周時明顯增多，規則排列，與骨長軸平行排列，新生骨內可見同心圓狀哈弗氏系統，成骨細胞、軟骨細胞散在分布于骨小梁周圍，數目明顯較6周時減少。

2.4 骨密度測定

第4、6周，實驗組骨密度值明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），第2周則無明顯統計學差異。

表1 骨密度測定（±s）

表1 骨密度測定（±s）

實驗組 0.294 2±0.009 30.323 2±0.004 4 0.356 4±0.007 9對照組 0.286 7±0.010 30.309 5±0.007 6 0.328 1±0.010 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

唑來膦酸作為第三代含氮雙膦酸鹽類藥物，具有強大的抗骨吸收作用，可抑制破骨細胞的活性或減少破骨細胞的數量，從而減少骨的丟失。在治療骨質疏松方面的作用是肯定的，現在國內臨床上已經大量應用于骨質疏松性壓縮骨折經皮椎體成形術（PVP）術后，以及絕經后老年女性的抗骨質疏松治療。其主要的藥理作用是通過抑制破骨細胞的活性來有效地抑制骨吸收。許多學者發現了甲羥戊酸通路對破骨細胞的功能十分重要，并且證明了含氮雙膦酸鹽是通過抑制該通路發揮作用的[2-4]。張健等[5]發現，唑來膦酸能夠抑制破骨細胞活性，而有關作用機制的研究主要集中在其作用途徑上。目前認為，含氮雙膦酸鹽能夠抑制骨吸收的分子生物學機制，主要是通過抑制甲羥戊酸途徑，尤其是作用于法尼基焦磷酸合成酶，從而抑制破骨細胞功能，誘導細胞凋亡的。此外，有學者認為[6]，唑來膦酸除了直接作用于破骨細胞外，還可以間接通過作用于成骨細胞來調節破骨細胞活性，從而抑制骨吸收。有研究[7]表明在低濃度范圍（≤10-9）mol/L時，唑來膦酸不影響成骨細胞增殖和堿性磷酸酶活性，而是促進骨鈣素基因表達，使得礦化沉積增加，表明唑來膦酸在低濃度范圍不影響成骨細胞的增殖，促進成骨細胞分化和礦化功能，一定程度上抑制了破骨細胞的活動，使骨吸收與骨形成達到平衡。

本研究得出，唑來膦酸的局部應用對骨折缺損區骨折的愈合確實有一定的作用。在第10周影像學檢查可以看出，實驗組骨密度較對照組骨密度明顯增加，且骨組織排列更加緊密；從組織學染色可以看出，實驗組較對照度骨小梁明顯增多，且更加粗壯，成骨細胞數量增加時間更早，新鮮骨組織更多，骨折斷端新鮮血管更加豐富。通過測定兩組骨密度情況可明顯看出實驗組骨密度較對照組有所增加。而且低濃度的唑來膦酸不僅減少骨質流失，而且促進血管的形成，使骨折斷端營養得到了保證，總而言之，經唑來膦酸浸泡的羥基磷灰石治療骨折缺損的效果是肯定的。但是對于唑來膦酸是否與羥基磷灰石發生進一步反應還需進一步探究。

圖3 高倍顯微鏡10×40結果