肉雞大腸桿菌病病原分離、鑒定及藥敏試驗

韓金宏 葛晨晨 李太元

摘 要：本文對延吉地區某雞場送來的10例肉雞大腸桿菌疑似感染病例進行病原分離與鑒定、菌株致病性試驗和藥物敏感性試驗等。就實驗結果進行分析，有8株疑似菌株，呈短桿狀，革蘭氏染色陰性菌，形態特征及生化鑒定符合大腸桿菌特性，確定為大腸桿菌菌株，具有較強的致病性，對β-內酰胺類、四環素類、氯霉素類藥物均有較強的耐藥性，但對喹諾酮類藥物的敏感性較強。

關鍵詞：大腸桿菌;鑒定;肉雞;藥敏試驗

大腸桿菌病是由致病性大腸埃希桿菌引起的一種較為常見的傳染性疾病，可造成人和畜禽的腹瀉、出血性胃腸炎，嚴重的可造成死亡，易對畜牧養殖業造成嚴重損害。

目前，臨床上防控大腸桿菌傳染常使用抗生素，而抗生素的濫用不僅會使耐藥菌大量產生，還會使得抗生素及耐藥菌株跟隨食物鏈進入人體，對人體健康造成一定程度的威脅。同時，全世界各地區流行的大腸桿菌菌株對于抗生素的耐藥性均有不同程度的差異，也給大腸桿菌的防控帶來了困難。本文通過一系列試驗并對結果進行分析，以期為大腸桿菌病的防控防治工作提供參考依據。

1.材料與方法

1.1肉雞病例

延吉某雞場送來5只疑似大腸桿菌感染致死的肉用雞及5只未死的同籠雞待檢。雞群出現流行病學癥狀后曾使用該養殖場常用的頭孢類藥物，但未能有效控制疾病傳播。

1.2主要藥品和試劑

實驗所用LB肉湯、麥康凱培養基、伊紅美蘭培養基及瓊脂粉均購自北京奧博星生物技術有限公司，革蘭氏染液購自河南柯炫生物技術有限公司，生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3主要儀器

壓力蒸汽滅菌器（MSL.N型），生物顯微鏡（BX53型），凈化工作臺（SW-CJ-2FD型），電熱恒溫培養箱（HH-B11？600-S型）。

1.4臨床觀察及采集樣品

病死雞剖檢可見：小腸、泄殖腔等粘膜彌漫性出血，有不同程度的出血點、出血斑;膽腫大;心外膜有黃白色膠凍樣纖維性滲出物附著;心包液增多、肝臟腫大、質脆、呈暗紅色或土黃色;就肝臟部分進行無菌采樣，進行實驗室診斷。對同籠活雞進行臨床診斷，發現同籠活雞出現精神沉郁，食欲減退的現象，且個別伴有腹瀉的癥狀，將活雞處死后對肝臟部分進行采樣并帶回實驗室。

1.5細菌分離及純化

無菌操作采集病料，在麥康凱培養基上進行劃線接種，置恒溫培養箱37℃下24h培養，選取紅色獨立菌落在麥康凱培養基上連續傳代3次后，在伊紅美蘭培養基上接種，選取紫黑色且帶有金屬光澤的菌落進行純化，并對該菌種進行保存。

1.6分離細菌的鑒定

1.6.1細菌形態及染色特性觀察

對分離菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察形態及染色特征。

1.6.2細菌生化實驗檢測

對分離純化的疑似菌株進行糖發酵試驗、V-P試驗、MR試驗、運動力試驗并觀察記錄，選取符合大腸桿菌生化特性的菌株進行致病性試驗。

1.7細菌致病性實驗

將生化鑒定后的大腸桿菌接種于LB肉湯液體培養基中培養24h，稀釋菌液至3×10？cfu/mL，備用;選用C57小鼠作為實驗動物，3只/組，設立對照組，腹腔注射稀釋菌液0.3ml/只，進行為期48h的觀察，記錄采食量、飲水量、精神狀態、排糞情況及其它病狀。及時進行剖檢及肝臟血涂片，顯微鏡下觀察細菌。

1.8細菌藥敏試驗

選用慶大霉素（GEN）、青霉素（P）、四環素（TET）、頭孢噻肟（CTX）、氧氟沙星（OFL）、氯霉素（C）等抗菌藥物進行藥敏試驗。

將分離出的大腸桿菌接種于普通培養基上培養18h，選取多個菌落用無菌生理鹽水配制成菌懸液，調整含菌量為1.5×10？cfu/mL，吸取350微升于4mm厚基礎培養基上，均勻涂抹后將預先準備好的藥敏紙片貼在培養基上，24h后觀察結果進行記錄分析。

2.結果與分析

2.1細菌形態觀察結果

細菌經革蘭氏染色，鏡下觀察呈革蘭氏陰性，菌體呈短桿狀，大小為0.3-0.6×1.1-1.7μm，單獨或成組分布，無芽孢（參見圖1）。

2.2生化試驗結果

分離細菌生化實驗結果如表1所示[1]。

2.3致病性試驗結果

攻毒6h后，小鼠普遍出現食欲不良，精神萎靡的癥狀，眼角出現白色顆粒狀物質;12h開始，出現死亡病例，肛門處有糞便漬粘于毛發上;36h后，不再出現死亡病例，食欲及飲水量逐漸恢復正常;48h后處死所有小鼠，進行剖檢及血涂片檢測，對照組始終未出現任何癥狀。

對病死的實驗鼠進行剖檢，普遍可見腹部膨大，有腹水，呈淡黃色膠凍樣液體，味惡臭，腸道有不同程度的出血點、出血灶;胃部腫大，積有膿性分泌物，個別可見壞死灶;肝部腫大，質脆，個別可見出血點、灰白色壞死灶或結節。處死的實驗鼠亦可見上述病況，但相對較輕。

肝臟血涂片鏡檢可以觀察到兩端鈍圓的G-短桿狀菌數量不等的散在排列在抹片上（參見圖2）。

根據致病性試驗結果分析可知，細菌形態且剖檢結果符合大腸桿菌致病病理變化。

2.4藥敏試驗結果

根據藥物敏感性實驗結果（見表2）參照多重耐藥（MDR）、泛耐藥（XDR）、全耐藥（PDR）多重耐藥菌暫行標準，計算菌株對各類藥物的耐藥率及敏感率（見表3）。

對藥敏試驗結果進行分析，大腸桿菌對青霉素、頭孢克肟、四環素、氯霉素藥物具有較強的耐藥性，而對氧氟沙星最為敏感，慶大霉素次之。

3.結論

根據上述實驗結果分析，該養殖場送檢的肉雞病例可以確定為大腸桿菌感染，所感染的大腸桿菌致毒力較強，易對該雞場的禽類造成嚴重損害，對生產養殖亦造成嚴重阻礙。且養殖場頻繁使用抗生素使得大腸桿菌耐藥性增強，對藥物的敏感率普遍較低。

4.建議

（1）輪換使用各類抗生素，避免同一類抗生素在一段時間內頻繁使用，少用或不使用耐藥性高的抗生素，慎用敏感性高的藥物。

（2）適當增加維生素和微生態制劑，以加強動物機體抵抗力;定時添加乳酸菌片，保證動物機體的腸道菌群平衡。

（3）做好飼養管理工作，保障飼養場所的干凈衛生和通風性，定期進行消毒清理工作，保證飲食質量，防止飲水和飼料受到污染。

（4）結合實際情況，選擇性地對畜禽進行免疫接種。

（5）及時發現并隔離患病畜禽，對整個畜群進行藥物防治，適當采用中西醫結合的治療方法。

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作者簡介：

一作：韓金宏（1998-），男，漢族，本科在讀，延邊大學，研究方向：動物醫學

二作：葛晨晨（1998-），男，漢族，碩士在讀，延邊大學，研究方向：微生物學

通訊作者：李太元（1962-），男，朝鮮族，碩士學位，教授，延邊大學，研究方向：微生物學與免疫學 .