單糖高效液相色譜法檢測技術應用研究進展

劉欣欣

摘要：高效液相色譜法具有靈敏度高、時效高以及操作簡單等多種優點，能夠很好的對單糖進行有效分析。由此，本文將詳細闡述通過高效液相色譜法檢測單糖的幾種方法，主要包括：柱前衍生法、柱后衍生法、蒸發光散射檢測法、示差折光檢測法、電噴霧檢測法等。并從這幾種方法的精確度、靈敏度以及操作方法等方面進行分析，詳細闡述這幾種方法的優點和缺點，希望可以為相關工作人員提供參考。

關鍵詞：檢測技術;高效液相色譜法;應用方法;研究進展;單糖

碳水化合物就是我們眾所周知的“糖”，這種物質是維持生命正常活動的主要能量，在自然界中有著廣泛的分布。而糖類有著4種存在形式，分別是多糖、單糖、低聚糖以及雙糖。其中，多糖具有抗腫瘤、美白保濕、降血糖、抗腫瘤、抑菌、降血脂以及抗感染等多種功效。所以，通過對多糖中的單糖組分進行研究，??????對研究其生物活性有著十分重要的作用;而通過高效液相色譜法進行檢測，能夠獲取更為準確的信息，也在相關研究中得到廣泛應用。

一、柱前衍生法

1.鄰氨苯甲酸衍生法

因為鄰氨苯甲酸存在著一定的刺激性以及毒性，不僅會對人體造成危害，還會對環境帶來破壞，導致其在實際中很少應用。有發達國家的研究人員通過將鄰氨苯甲酸作為單糖的衍生試劑進行分析，發現其具有靈敏度高、操作簡單以及易獲得等多種優點。還有國內的研究人員通過使用其作為衍生劑，結合高效液相色譜法對單糖進行檢測，發現這種方法具有很高的回收率，還具有可重復操作性的特點。但是，因為其對流動相有著很高的要求，再加上這一衍生劑具有毒性，在使用這種方法時需要按照相關流程操作，避免出現意外，故其使用范圍受到一定限制。

2.對氨基苯甲酸衍生法

由于對氨基苯甲酸屬于苯甲酸的苯環上對位被氨基取代后所形成的的一種化合物，存在中等程度的毒性。通過其能夠與單糖產生反應，獲取一種可以被檢測的物質，這種檢測方法均有靈敏度高、操作簡單的特點，能夠快速并準確對樣品進行檢測。然而，由于其存在著一定的毒性，所以在現實中的應用比較少。有研究人員通過這種方法對9種單糖進行檢測，并適當的對衍生條件進行了一定的優化。發現通過對衍生條件進行優化后，測得9種單糖的RSD值均低于4%，r2均大于0.997，有著十分良好的線性關系，單糖衍生化產物的峰面積也沒有出現較大變化。然而，其中也存在幾種單糖分離度不佳的問題，所以，通過對HPLC-FID法對酸漿多糖進行檢測，并開展梯度洗脫，從中分離的幾種單糖效果較好，而且靈敏度也比較高，但是操作步驟比較繁瑣[1]。

二、柱后衍生法

現如今有關柱后衍生法的參考資料并不是很多，只有小部分研究人員采用這種方法開展對單糖的檢測。有國內研究人員基于柱后衍生法，結合高效液相色譜熒光法對4種單糖（D-果糖、山梨醇、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖）進行檢測，發現這種檢測方法有陣令人滿意的靈敏度，然而這種檢測方法過于復雜，再加上1-萘硼酸有著一定的毒性，這就極大的影響了該方法的使用范圍[2]。

雖然柱前衍生法具有檢測成本低的優點，但是其在衍生時，很容易引入部分雜質，這就會對色譜分離造成極大的影響，甚至會導致試驗結果出現誤差。而柱后衍生法即使產生了副產物，也不會對試驗的結果造成影響，并且其對穩定性沒有很高的要求，但是需要有相關的設備，這樣會提高成本投入，再加上反應條件存在限制，所以未得到廣泛應用。

三、示差折光檢測法

液相色譜示差折光檢測法是我國目前單糖測定的標準方法。這種方法需要使用專門的示差折光檢測器進行檢測，通過這種方法對單糖進行檢測不需要衍生處理，所以能夠有效提高檢測效率，并能夠很好的對各種組分進行分離，得到了十分廣泛的應用。然而，這種方法很容易受到流速、流動相以及溫度環境等多種因素的影響，導致其靈敏度不佳，還無法使用梯度洗脫。

四、蒸發光散射檢測法

液相色譜蒸發光散射檢測法也是需要使用相關的儀器進行檢測，主要是蒸發光散射檢測器，這是一種基于示差折光檢測器而誕生的儀器。這種檢測方法的優點在于不僅能夠保留示差折光檢測器的優點，還可以彌補其存在的弊端，如無法被梯度洗脫、靈敏度不佳等，還可以有效的消除溫度以及流動相對其造成的影響。有研究人員使用這種方法對10種蜂蜜中的單糖進行檢測，發現檢出限為每升10毫克，確認其能夠很好的彌補示差折光檢測器的不足[3]。

電噴霧檢測法

液相色譜電噴霧檢測法是近年來一種新興技術，其是一種基于蒸發光散射檢測器而誕生的儀器，是一種通用型質量檢測器。其較蒸發光檢測器靈敏度在同一化合物的檢測限可高出一個數量級，且重現性好、檢測范圍更寬，且其工作溫度基本在常溫下完成，對活性物質的熱穩定性影響較小，在一定程度上彌補了蒸發光散射檢測器的不足，在單糖檢測方面已開始應用，有待進一步拓展[4]。

六、結束語

總而言之，近些年來在單糖的分析中高效液相色譜法得到了十分廣泛的應用，通過對其使用的現狀進行分析，可以發現未來的研究方向應該有兩點：首先，在柱前衍生中，PMO柱前衍生的使用范圍最為廣泛，然而在進行操作時需要加入衍生劑，這就會導致部分雜質融入其中，影響到試驗結果的準確性。所以，就需要解決掉誤差問題。其次，蒸發光散射檢測法及電噴霧檢測法具有靈敏度較高無需衍生的特點，但是正是因為不需要衍生導致其保留及各單糖組分間分離度較差，這就需要想辦法提高其保留及分離度，才能夠更好的得到應用。

【參考文獻】

方宏， 曾健智. 高效液相色譜法檢測蔗渣光纖維素水解物中的單糖[J]. 廣西科學院學報， 2018，16（3）：124-126.

[2]熱孜萬古力·賽買提， 陳士恩， 高丹丹，等. 單糖高效液相色譜法檢測技術研究進展[J]. 食品與機械， 2018，v.34;No.196（2）：191-196.

[3]?田靈敏， 邱雪梅， 潘子敬， 等. 新型糖組成高效液相色譜分析技術的構建及其在水飛薊多糖質控中的應用[J]. 藥學學報，2018，（4）：90-96.

[4]李心怡，蔣運斌，馬逾英.電噴霧檢測器在藥物HPLC分析中的優勢及應用進展[J]. 中國藥房，2017，28（15）：2152-2155.