miRNA-132通過靶向PDCD4在多發性骨髓瘤細胞黏附介導的耐藥性中的作用

周佳妮 馬泳泳

[摘要] 目的 探討miR-132對程序性死亡4基因（PDCD4）的靶向作用，及其在多發性骨髓瘤細胞黏附介導的耐藥性中的作用。 方法 利用熒光素酶報告基因分析miR-132對PDCD4的靶向調控關系。對人骨髓瘤細胞株U266進行miR模擬物和抑制物轉染，之后比較地塞米松（Dex）、多柔比星（Dox）、硼替佐米（Bort）處理下U266細胞的藥物敏感性。Transwell法檢測U266細胞的遷移能力。MTT法和CCK-8法檢測細胞增殖活性。 結果 Dex和Dox干預后細胞的抑制率顯著上升（P < 0.05），而Bort干預后細胞的抑制率無顯著變化（P > 0.05）。熒光素酶報告基因分析結果證實PDCD4是miR-132的靶基因。上調miR-132可以抑制PDCD4基因和和蛋白的表達（P < 0.05）。miR-132上調后U266細胞的遷移距離顯著增加（P < 0.05）。miR-132上調后U266細胞的黏附率和增殖活性顯著增加（P < 0.05）。 結論 miR-132可以靶向PDCD4調控多發性骨髓瘤細胞黏附介導的耐藥性。

[關鍵詞] miR-132;程序性死亡4基因;多發性骨髓瘤;耐藥性;細胞黏附

[中圖分類號] R741? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（b）-0004-05

The role of miRNA-132 in multiple myeloma cell adhesion mediated drug resistance by targeting PDCD4

ZHOU Jia′ni1? ?MA Yongyong2

1.Department of Hematology， Ningbo Medical Center Li Huili Hospital， Zhejiang Province， Ningbo? ?315000， China; 2.Department of Hematology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To explore the targeting effect of miR-132 on programmed death 4 gene （PDCD4） and its role in the adhesion mediated drug resistance of multiple myeloma cells. Methods Luciferase reporter gene was used to analyze the targeting regulation of miR-132 on PDCD4. Human myeloma cell line U266 was transfected with miR mimic and inhibitor， and then the drug sensitivity of U266 cells treated with Dexamethasone （Dex）， Doxorubicin （Dox） and Bortezomib （Bort） was compared. Transwell method was used to detect the migration ability of U266 cells. MTT and CCK-8 methods were used to detect cell proliferation. Results After Dex and Dox intervention， the inhibition rate of cells increased significantly （P < 0.05）， while the inhibition rate of Bort did not change significantly （P > 0.05）. Luciferase reporter gene analysis confirmed that PDCD4 was the target gene of miR-132. Up regulation of miR-132 could inhibit the expression of PDCD4 gene and protein （P < 0.05）. The migration distance of U266 cells increased （P < 0.05）. After miR-132 was up-regulated， the adhesion rate and proliferation activity of U266 cells increased （P < 0.05）. Conclusion miR-132 can target PDCD4 to regulate multiple myeloma cell adhesion mediated drug resistance.

[Key words] miR-132; Programmed death 4 gene; Multiple myeloma; Drug resistance; Cell adhesion

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）屬于惡性漿細胞病[1-4]。MicroRNAs（miR）為非編碼小RNA，可參與調控腫瘤的發生，侵襲及轉移，耐藥等行為[5-7]。miR-132在MM中鮮有報道。程序性死亡4基因（programmed cell death 4，PDCD4）屬于抑癌基因，其低表達水平下降可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。既往研究證實，通過調節PI3K/AKT信號通路可調控PDCD4基因參與人子宮內膜癌的發生發展過程[8-9]。本研究驗證了miR-132與PDCD4靶向調控的關系，以及對U266細胞生長及耐藥的影響，具體報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞

人骨髓瘤細胞株U266購自上海江林生物科技有限公司，培養于完全培養基（RPMI1640基礎培養基中添加10%胎牛血清同時添加雙抗，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg/mL），培養條件為37℃，5%CO2。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物抑制試驗? U266細胞先轉染miR-132抑制劑（終濃度為100 nmol/L），之后使用地塞米松（Dexamethasone，Dex）50 nmol/L，多柔比星（Doxorubicin，Dox）100 nmol/L，硼替佐米（Bortezomib，Bort）5 nmol/L處理U266細胞，培養48 h后檢測細胞活性，并計算抑制率，抑制率=（OD未處理孔-OD加藥孔）/OD未處理孔×100%。

1.2.2 miR模擬物和抑制物轉染? 將U266細胞轉移至6孔板中，加入含2.5 μL模擬物的100 μL培養基，靜置5 min，加入轉染試劑Lipofectmine2000（Invitrogen公司，批號：33658），靜置20 min，每孔加入800 μL無血清培養基，模擬物的終濃度為50 nmol/L，抑制物的終濃度為100 nmol/L。細胞分組：轉染模擬物的細胞為模擬物組，轉染抑制物的細胞為抑制物組，未做任何處理的細胞為未處理組，采用PBS作參照的細胞為PBS組。

1.2.3 RT-PCR檢測? 用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：15596026）提取細胞總RNA。逆轉錄后進行RT-PCR檢測。每個樣本重復3次。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，54℃退火15 s，72℃延伸10 s，收集熒光，共40個循環。

1.2.4 熒光素酶報告基因分析? PDCD4的WT或MUT 3′-UTR質粒由科雷生物科技有限公司提供。將質?？寺≈羛GL3 Basic載體中，將50 nmol/L miR-132模擬物與10 μg PDCD4轉染U266細胞[10]。用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海滬震實業有限公司，批號：11402HZ60）測定熒光素酶活性。

1.2.5 細胞遷移能力檢測? 使用Transwell侵襲小室（美國Costar公司，批號：3422）檢測U266細胞的遷移能力。檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 細胞黏附實驗? 培養U266細胞懸液接種于96孔板中，培養12 h，加入MTT（美國Sigma公司，M1218）在培養箱中培養4 h，加入DMSO 200 μL，震蕩10 min。黏附率=A黏附細胞/A總細胞×100%。

1.2.7 細胞活性檢測? 使用MTT法和CCK-8檢測細胞活性。MTT和CCK-8試劑盒均購于美國Sigma公司，批號分別為M1218和T6522，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.8 Western blot檢測? 收集細胞蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，隨后進行轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育。使用Image QuantTMLAS4000成像系統（美國GE公司）顯色。本研究以GAPDH作為內參。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗;以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U266細胞轉染模擬物和抑制劑后miR-132的表達

轉染模擬物后U266細胞中miR-132的表達顯著升高（圖1A、B）。轉染模擬物的U266細胞中miR-132的表達顯著升高，而轉染抑制劑的U266細胞中miR-132的表達顯著降低（P < 0.05）（圖1C）。

A、B：U266細胞轉染模擬物和抑制劑后miR-132的表達（400×）;C：四組miR-132的相對表達水平比較。與PBS組比較，**P < 0.01;與未處理組比較，##P < 0.01;與模擬物組比較，$$P < 0.05

2.2 miR-132表達水平對U266細胞藥物敏感性的影響

在未處理的U266細胞中，Dex的抑制率為（14.28±0.25）%，Dox的抑制率為（31.05±1.03）%，Bort的抑制率為（28.16±1.04）%;在加入抑制劑的U266細胞中，Dex的抑制率為（36.24±2.06）%，Dox的抑制率為（42.36±3.16）%，Bort的抑制率為（30.12±1.25）%。與未處理條件下各種藥物的抑制率比較，加入抑制劑的細胞中Dex和Dox的抑制率顯著上升，差異有統計學意義（P < 0.05），而Bort的抑制率無顯著變化（P﹥0.05）。

2.3 miR-132對PDCD4的靶向作用

Target Scan（www.targetscan.org）預測結果顯示，PDCD4是miR-132的靶基因。PDCD4 3′UTR包含miR-132的保守結合區（圖2A）。miR-132模擬物與包含WT-PDCD4的熒光素酶載體共轉染后，降低了U266細胞的活性，熒光素酶活性分別下降66.02%和73.06%（P < 0.05）（圖2B）。miR-132模擬物可以下調PDCD4基因和蛋白的表達（P < 0.05）（圖2C、D）。

2.4 miR-132對PDCD4表達的影響

抑制miR-132的表達可顯著上調PDCD4的mRNA水平（P < 0.05）（圖3A）。抑制miR-132的表達可顯著上調PDCD4的蛋白水平（圖3B）。

2.5 不同處理條件下U266細胞的遷移能力和黏附率比較

miR-132上調后U266細胞的遷移距離顯著增加，抑制miR-132表達可降低U266的遷移距離（P < 0.05）（圖4A、B）。miR-132上調后U266細胞的黏附率顯著增加，反之下降（P < 0.05）（圖4C、D）。

2.6 不同處理條件下U266細胞的增殖活性

與未處理組U266細胞的增殖活性比較，miR-132上調后U266細胞的增殖活性顯著增加，當miR-132的表達受到抑制時，U266的增殖活性降低（P < 0.05）。見圖5～6。

3 討論

在MM的發生發展過程中，多種miRNA表達異常[11-14]。miR-132與多種疾病的發生發展相關，在多種疾病中出現異常變化[15-16]，例如Diao等[17]發現miR-132可通過調控其靶基因scn1a和scn2a的表達參與記憶的過程。有研究表明[18-19]，miR與腫瘤耐藥相關。Dex、Dox、Bort是治療MM的常用藥物。本研究發現，miR-132表達下調可提高U266對Dex和Dox的耐藥率，而對Bort的耐藥率無影響。

PDCD4為抑癌基因，其表達量降低提示腫瘤患者的不良預后，因此PDCD4可成為治療腫瘤的新靶點[10]。有研究證實[20]，miR-132可能通過抑制PDCD4的表達參與腫瘤生長和轉移的過程。本研究提示，PDCD4是miR-132的靶基因。抑制miR-132的表達可顯著上調PDCD4的mRNA水平和蛋白水平，以此提示miR-132可通過調節靶基因PDCD4的表達進而參與到腫瘤細胞的發生發展過程。本研究中使用化學合成的miR-132的模擬物和抑制物轉染U266細胞，結果顯示，未轉染或轉染抑制劑的U266細胞顯示出較強的遷移能力，且細胞的黏附能力降低，以此提示抑制miR-132的表達可降低U266細胞的運動能力，骨髓瘤細胞中miR-132對PDCD4有調控作用，說明這可能與PDCD4的參與有關。

綜上，miR-132在MM的進展中起到重要作用，本研究發現miR-132的下調可抑制骨髓瘤細胞的遷移能力和黏附能力。PDCD4是miR-132的靶點。miR-132可能是治療MM的靶點。

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