外源糖類和維生素對萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi孢子萌發的促進作用

劉守柱　劉雙雙　姜武玲　王馨玫　王文杰

摘要：萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi是重要的昆蟲病原真菌，對鱗翅目害蟲有很好的防治效果，但存在殺蟲速度慢的缺點。為了提高萊氏綠僵菌孢子的萌發速度，縮短對寄主的致死時間，在孢子懸液中分別添加不同糖類和維生素類，以測定外源營養對萊氏綠僵菌孢子萌發的促進作用。配制含有不同濃度糖和維生素的SMY液體培養基后，接種M.rileyi孢子，25℃、180 r/min振蕩培養，每隔24 h，用血球計數板鏡檢孢子萌發率。結果表明：接種24 h后，以10 g/L甘露糖、5 g/L維生素B6和5 g/L維生素C對孢子萌發的促進作用較好，孢子萌發率分別為3.50%、3.67%和0.83%;隨著培養時間延長，10 g/L甘露糖、5 g/L維生素C依然對孢子萌發有較好的促進作用，5 g/L維生素B6對孢子萌發的促進作用逐漸降低;進一步測定甘露糖和維生素C對孢子萌發的濃度效應，甘露糖濃度為25.0 g/L時對孢子萌發的促進作用最好，維生素C濃度為0.2 g/L時最好。以上結果表明，對M. rileyi孢子萌發促進效果最好的外源營養是甘露糖和維生素C，最適濃度分別是25.0 g/L和0.2 g/L。

關鍵詞：萊氏綠僵菌;孢子萌發;糖;維生素

中圖分類號：S476.12文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）03-0097-05

AbstractMetarhizium rileyi is an important entomopathogenic fungus with good control effect against Lepidopteran pests， while its insecticidal speed was slow. Hence， the promotion effects of external saccharides and vitamins on spore germination of Metarhizium rileyi were analyzed to find a way to shorten the lethal time and improve the spore germination speed of M. rileyi on host. The conidia of M. rileyi were inoculated into 6 saccharide and 4 vitamin fluid media， and cultured in the conditions of 25℃ and 180 r/min on the incubator shaker;the germinated spores were counted by hemocytometer under microscopy every 24 h after inoculation. The results showed that 10 g/L mannose， 5 g/L vitamin B6 and 5 g/L vitamin C had better promotion effects on spore germination after 24 h， and the spore germination rates were 3.5%， 3.67% and 0.83% respectively. With the extension of culture time， 10 g/L mannose and 5 g/L vitamin C still had better promoting effects on spore germination， while the promoting effect of 5 g/L vitamin B6 gradually decreased. Further study showed that mannose had the best promotion effect when the concentration was 25.0 g/L， while the optimum concentration of vitamin C was 0.2 g/L. It was concluded that mannose and vitamin C were the best external nutrients in promoting spore germination of M. rileyi at the concentrations of 25.0 g/L and 0.2 g/L，respectively.

KeywordsMetarhizium rileyi; Spore germation; Saccharide; Vitamin

萊氏綠僵菌（Metarhizium rileyi）隸屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麥角菌科（Clavicipitacea）綠僵菌屬（Metarhizium），舊稱萊氏野村菌Nourmeae rileyi[1]，是一種在自然界廣泛分布的昆蟲病原真菌，對多種鱗翅目害蟲，尤其是夜蛾科害蟲，如甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[2，3]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[4]、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）[5，6]、新入侵我國的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[7]等，共計60多種害蟲[8]均有明顯的致病作用，是一種具有廣闊應用前景的生防真菌。昆蟲被M. rileyi侵染死亡后，蟲體僵硬，菌絲由內向外穿透體表，在僵尸表面大量產孢，形成綠色霉層。成熟孢子在田間可借助氣流、水流進行擴散傳播，黏附到其他蟲體表面后，孢子萌發形成再侵染，導致昆蟲疾病在一定的區域內自然流行，因而可以長久控制害蟲的種群數量，這種疾病流行能力可以在田間人工誘導發生[9]。

M. rileyi的侵染過程起始于孢子在昆蟲體壁表面的萌發。孢子萌發后產生芽管，然后芽管分泌幾丁質酶[10]等降解昆蟲表皮，穿透體壁后進入血腔，完成侵染過程。由此可見，M. rileyi孢子的萌發能力與侵染成功的幾率有直接的聯系，萌發速度快，萌發率高，相應會提高病原菌的侵染成功率和致死效果。在自然條件下，孢子黏附到昆蟲體表后，由于昆蟲上表皮堅硬、疏水性強、缺少游離的營養物質[11]，因而孢子處于外源營養極度貧乏的狀態，僅能依靠自身儲備營養進行萌發。如果在此過程中，添加適量的營養物質，如油類和糖類，能協助或促進孢子萌發的幾率[12]，延長芽管生存時間，必將會提高病菌的侵染、致死效果。

為了提高M.rileyi分生孢子在營養缺乏狀態下的萌發幾率，增強對害蟲的寄生作用，本研究以較為常見且水溶性較好的糖類和維生素類作為外源營養，在離體條件下測定兩類物質對孢子萌發的促進作用，以期為提高M. rileyi 的田間應用效果提供有益借鑒。

1材料與方法

1.1供試菌株

M. rileyi Nr5772菌株，聊城大學農學院昆蟲研究室提供。菌種用薩氏麥芽糖瓊脂酵母（SMAY）固體培養基進行繼代培養，連續培養4～5代后接種至斜紋夜蛾幼蟲體內進行復壯，再次純化后保存備用。

1.2供試糖及維生素

選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘露糖6種糖類及維生素C、維生素B1、維生素B3、維生素B6 4種維生素類作為外源營養，測定其對M. rileyi孢子萌發的影響。

1.3孢子萌發的測定

在無菌條件下，用挑針挑取適量孢子粉，轉移到含有0.10 g/L吐溫80的無菌水中，充分振蕩混勻后，用血球計數板計數后，調整孢子濃度為每毫升1×107個，備用。

1.3.1外源糖類和維生素對孢子萌發的影響稱取0.2 g糖類，加入到150 mL三角瓶中，然后加入19 mL無菌水使之充分溶解，再加入1 mL配好的孢子懸浮液，配成糖濃度為10 g/L的孢子懸浮液，25℃、180 r/min振蕩培養，以不加糖的孢子懸浮液作為對照組。相同方法，分別稱取維生素0.1 g，配制維生素濃度為5 g/L的孢子懸浮液，以測定不同種類維生素對孢子萌發的影響。所有處理均重復3次。

1.3.2孢子萌發測定每隔24 h用光學顯微鏡觀察、記錄孢子萌發情況。觀察時，從各組處理當中移出少量培養液，在顯微鏡下用血球計數板觀察孢子的萌發情況并計數，記錄各時間孢子的萌發個數，并計算出各時間的孢子萌發率。共觀察96 h。

1.3.3外源糖類和維生素對孢子萌發的濃度效應根據1.3.2的測定結果，選擇對孢子萌發促進效應最好的糖和維生素，分別設置0.2、1.0、5.0、25.0、100.0 g/L系列濃度，測定不同濃度下孢子的萌發率，以確定濃度對孢子萌發的影響。

1.4數據統計分析

所有數據采用Microsoft Excel 2016軟件進行計算，采用STDEV.P函數進行誤差估計;多重比較采用DPS 7.05軟件Duncans新復極差法進行。

2結果與分析

2.1外源糖類對M.rileyi孢子萌發的促進作用

振蕩培養24 h，M. rileyi孢子在10 g/L蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、阿拉伯糖溶液中未見萌發或極少萌發，表明以上糖類在供試濃度下對孢子萌發沒有促進作用;而在10 g/L甘露糖溶液中M. rileyi孢子平均萌發率3.5%，明顯好于其他糖類（表1）。經方差分析，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、阿拉伯糖處理組與對照組差異不顯著，與甘露糖處理差異顯著。

培養48 h，各處理以及對照組孢子均有不同程度萌發，但仍以10 g/L甘露糖處理組的萌發率最高。10 g/L葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、阿拉伯糖處理組孢子萌發率雖然低于甘露糖處理，但明顯高于對照組，說明以上糖類也有促進孢子萌發的作用。

培養72～96 h，隨著培養時間的延長，蔗糖和葡萄糖處理組的孢子萌發率快速升高，與甘露糖處理組相近，說明蔗糖和葡萄糖對孢子萌發的促進作用在培養的后半段較為顯著。

2.2外源維生素對M.rileyi孢子萌發的促進作用

培養24 h，M. rileyi孢子在維生素B6和維生素C溶液中萌發，而在維生素B1、維生素B3和對照處理中未見萌發。其中，維生素B6的促進作用好于維生素C（表2）。

培養48 h，各種維生素及對照溶液中均有孢子萌發，其中維生素B6處理的萌發率最高，其次為維生素C處理，兩者間差異不顯著，但顯著高于其他處理。

培養72 h，維生素C處理中的孢子萌發率最高，達44.17%，顯著高于維生素B6（12.33%）及其他處理的萌發率。前期表現較好的維生素B6萌發率漲幅不大，說明持效性較差。持續培養至96 h，各處理之間的趨勢與培養72 h時基本一致。

綜合表1和表2，10 g/L甘露糖、5 g/L維生素C在培養24～48 h內對孢子萌發有明顯的促進作用，并且有比較好的持效性，因而選擇二者作為孢子萌發促進劑，進行下一步的濃度效應測定。雖然5 g/L維生素B6在24～48 h階段內也有很好的促進作用，但后期增幅不大;與之相反，10 g/L葡萄糖溶液在72～96 h階段內有很好的促進作用，但在24～48 h內促進萌發的作用較低，說明維生素B6和葡萄糖對孢子萌發的整體效果較差，因而不能作為良好的孢子萌發促進劑。

2.3甘露糖促進M.rileyi孢子萌發的濃度效應

在不同濃度甘露糖溶液中，M. rileyi孢子的萌發率變化趨勢相似（圖1），即在0.2～25.0 g/L范圍內，孢子萌發率隨著糖濃度的升高而增高，此后快速下降;最有利于孢子萌發的甘露糖濃度為25.0 g/L。在相同濃度甘露糖溶液處理下，隨著培養時間的延長，萌發率總體來說呈升高趨勢。

2.4維生素C促進M.rileyi孢子萌發的濃度效應

從圖2中可以看出，M. rileyi孢子在低濃度維生素C溶液中萌發率較高，在高濃度溶液中萌發率較低，萌發率與維生素C濃度呈明顯的負相關關系，最有利于孢子萌發的濃度為0.2 g/L。在相同濃度維生素C溶液處理中，孢子萌發率隨培養時間的延長而升高。

3討論與結論

眾所周知，生物防治是害蟲綜合治理的重要方法，以其良好的環境安全性和對人畜的低毒性而在農業生產尤其是蔬菜生產中廣泛應用。據統計，從2013—2017年，國際期刊發表的生物防治論文以每年20%的速度穩步遞增[13]，說明該領域吸引了眾多研究人員參與，具有廣闊發展前景。雖然生物防治有其獨具的優點，但也有嚴重的應用瓶頸，例如嚴重依賴環境條件、效能低、致死速度慢等[14-16]，這在利用昆蟲病原真菌防治害蟲時尤為突出。

前期研究已經表明，導致萊氏綠僵菌殺蟲速度慢的主要障礙是昆蟲的體壁防御，一旦病原菌穿透寄主體壁（cuticle penetration）進入血腔，即使病原菌數量僅為400個/幼蟲，亦可在3天內致寄主死亡[17]。M. rileyi孢子的體壁穿透效率低是其殺蟲速度慢的主要原因，在此過程中，孢子的萌發率與體壁穿透率有直接關系，相同條件下孢子萌發率高必然提高體壁穿透效率，最終縮短致死時間。因而，提高孢子萌發率，尤其是研究有利于提高孢子萌發率的劑型，一直是生防真菌應用研究中的重要內容[18-20]。

從本研究結果看，除了研究有利于保存孢子萌發率的劑型以外，額外添加一些外源營養物質作為孢子萌發促進劑，也可以明顯提高孢子萌發率，且以甘露糖和維生素C的效果最佳。進一步研究表明：甘露糖的最適質量濃度為25.0 g/L，濃度低時對M. rileyi孢子萌發的促進作用較低，而高時則出現抑制作用;維生素C在低濃度時對孢子萌發促進作用明顯，高濃度時有抑制作用，最適質量濃度為0.2 g/L。根據以上結果，在制備M. rileyi分生孢子制劑或者在田間應用時，可以人工添加適量的甘露糖或維生素C作為孢子萌發促進劑，以提高生防效果。

需要指出的是，本研究結果是在室內離體條件下測定的，并不能如實反映出活體條件下的促進作用。許多因素，例如活體昆蟲上表皮及微觀結構是否能吸收或消化額外添加的外源營養，孢子-外源營養-昆蟲表皮三者之間的互作機制，均可以影響到外源營養對孢子萌發的促進作用，因此能不能在活體昆蟲體壁表面也取得相同的效果尚需進一步試驗確定。

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