4個芍藥品種與3個牡丹品種的遠緣雜交結實特性研究

祁奇墨　孟凡志　國靜　邢廣萍　郭先鋒

摘要：開展芍藥與牡丹遠緣雜交研究對于保障我國芍藥產業的可持續發展具有重要意義。本研究以課題組前期篩選出的4個結實率較高的芍藥品種為母本，以3個牡丹品種為父本，設計12個雜交組合，以飽滿種子數、結實心皮率、百粒重等作為評價指標，對比篩選各雜交組合的結實情況。結果如下：篩選出雜交親和性高的4個組合，分別為‘紫鳳羽ב月宮燭光、‘紫鳳羽ב層中笑、‘紫鳳羽ב花王、‘矮粉1號ב層中笑，其每果飽滿種子數分別為16.50、12.00、9.13、2.57粒，結實心皮率分別為52.50%、60.00%、4706%和73.68%。本研究結果對于進一步培育芍藥屬新品種具有重要的指導價值。

關鍵詞：芍藥;牡丹;遠緣雜交;結實特性

中圖分類號：S682.1+20.36+S567.1+50.351文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）03-0024-05

Abstract The study of distant hybridization between herbaceous peony and tree peony is of great significance for safeguarding the sustainable development of peony industry in China. In the study， twelve distant hybridization combinations were designed with four herbaceous peony cultivars as female parents and three tree peony cultivars as male parents. The seed-setting characteristics were compared according to the parameters such as the number of full seeds， ratio of fertile carpels and 100-seed weight. The results showed that four combinations with high cross compatibility were screened out， including ‘Zi FengyuבYuegong Zhuguang， ‘Zi FengyuבCengzhong Xiao，‘Zi FengyuבHuawang and ‘Aifen 1בCengzhong Xiao. The number of full seeds per follicle of the four combinations were 16.50， 12.00， 9.13 and 2.57， respectively， while the ratio of fertile carpels were 52.50%， 60.00%， 47.06% and 73.68%， respectively. These results would provide significant references for further breeding new varieties in Paeonia.

Keywords Herbaceous peony; Tree peony;Distant hybridization; Seed setting characteristics

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）是芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）的多年生草本植物，是中國的傳統名花，廣泛栽培于園林綠地。芍藥與牡丹雖為同屬植物，但前者為草本，屬于芍藥組[1]，后者為木本，屬于牡丹組，二者間雜交屬于組間的遠緣雜交，這種組間雜交長期以來被認為極具挑戰性[2]。與大多數植物遠緣雜交一樣，牡丹與芍藥的遠緣雜交往往表現出雜交不親和、胚敗育以及雜種不育的特性[3]，而雜交親和性與親本的遺傳型有密切關系，因此找到適宜的親本或親本組合是雜交成功的關鍵。目前國內對芍藥結實特性尤其是遠緣雜交方面的研究較少，隨著近些年來國外組間遠緣雜交的不斷成功[4，5]，我國學者也開始在芍藥屬組間雜交方面進行一些有益的嘗試，例如：張棟通過組間雜交的方式，從48個雜交組合中收獲1 715粒種子[6];王越嵐以川赤芍作為父本、牡丹作為母本進行反交，平均結實11.63粒/朵[7]。

本課題組前期通過對芍藥品種性狀的調查研究，篩選出4個結實率較高的芍藥品種，并對芍藥和牡丹的遠緣雜交進行了試驗，收獲了一定數量的種子。在此基礎上，本試驗選擇‘鳳凰涅槃、‘矮粉1號、‘迷你、‘紫鳳羽4個結實特性優良的芍藥品種為母本，采用3個具有優良性狀的牡丹品種作為父本進行人工授粉雜交，調查分析其結實特性，以期探究特定遠緣雜交對芍藥結實特性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以本課題組前期篩選出的‘鳳凰涅槃、‘迷你、‘紫鳳羽和‘矮粉1號4個結實率較高的芍藥品種為母本，以‘層中笑、‘花王和‘月宮燭光3個牡丹品種為父本，共計12個雜交組合。每個雜交組合授粉25朵花，分別以母本芍藥天然異花授粉為對照。父母本植株均種植于山東農業大學南校區試驗基地，管理水平良好，植株生長健壯。

1.2 試驗方法

1.2.1 父本花粉采集與萌發率測定 在牡丹含苞欲放期采集花粉，陰干，分裝于離心管中，置于4℃冰箱中保存。采用液體培養基（10 g蔗糖+0.1 g硼酸+100 mL蒸餾水）培養花粉并測定花粉萌發率[8]。培養條件為25℃，黑暗培養6 h，每個品種3個重復。OLYMPUS光學顯微鏡下觀察并拍照。花粉管萌發長度大于或等于花粉粒直徑視為花粉萌發。花粉萌發率=萌發花粉粒數/花粉粒總數×100%。

1.2.2 人工授粉 2019年5月初，每株選取5朵含苞待放的主蕾花朵，于花藥尚未散粉前去除全部雄蕊，去雄后立即用硫酸紙袋套住花苞。待柱頭大量分泌粘液時，人工授予父本花粉，經常觀察授粉情況，對授粉效果較差的花朵進行補授。授粉后立即套好硫酸紙袋，并注明雜交組合、授粉時間等信息。授粉后約7 d時，摘除硫酸紙袋，避免雌蕊霉爛。

1.2.3 雜交結實率統計 2019年8月上旬于芍藥蓇葖果稍稍開裂、種子尚未脫落時，收獲蓇葖果。分別統計和計算如下指標：蓇葖果重量（g）、心皮數（個/蓇葖果）、結實心皮數（個/蓇葖果）、飽滿種子數（粒/蓇葖果）、不飽滿種子數（粒/蓇葖果）、每心皮種子數（粒）、百粒重（g）、結實胚珠率（%）和結實心皮率（%）。其中，結實心皮率（%）=結實心皮數/蓇葖果心皮數×100。

1.2.4 數據分析 采用SPSS 19.0、Microsoft Excel和GraphPad Prism 8.0軟件對試驗數據進行分析及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 父本花粉的萌發特性

對采集的‘層中笑、‘花王和‘月宮燭光3個牡丹品種的花粉進行萌發率測定，結果顯示：‘層中笑和 ‘花王花粉萌發率高達近90%，‘月宮燭光花粉萌發率較低，為65.57%（圖1）。3個牡丹品種的花粉萌發率均高于60%，適宜作為父本進行雜交授粉試驗[8]。

2.2 母本的自然結實特性

4個母本芍藥品種自然授粉情況下的結實特征見表1，可以看出：4個芍藥品種的心皮數具有差異，‘迷你最多，平均為6個;其次為‘鳳凰涅槃和‘紫鳳羽，為5個，‘矮粉1號為4個。結實后，蓇葖果重量、結實心皮率、飽滿種子數、每心皮種子數、結實胚珠率都是衡量結實特性的重要指標，據此，‘鳳凰涅槃最優，其次為‘迷你，二者均明顯優于另外2個母本品種。百粒重是衡量種子質量的重要指標，4個品種間比較，‘鳳凰涅槃>‘矮粉1號 >‘紫鳳羽>‘迷你。綜合來看，‘鳳凰涅槃的自然結實性狀最優。

2.3 不同雜交組合的結實特性

不同雜交組合收獲的飽滿種子數見圖2，從中可知，以 ‘紫鳳羽為母本收獲種子數最多，共118粒;其次為以‘矮粉1號為母本，共收獲種子19粒;以‘迷你和‘鳳凰涅槃為母本收獲種子數很少，尤其以‘鳳凰涅槃為母本，僅‘鳳凰涅槃ב花王組合收獲1粒種子。各雜交組合中，‘紫鳳羽ב花王組合收獲的種子數最多，達到73粒;‘紫鳳羽ב月宮燭光組合收獲種子數也較多，為33粒;‘矮粉1號ב層中笑、‘紫鳳羽ב層中笑組合分別為18粒和12粒;其余組合均少于3粒或沒有飽滿種子。

由表2可見，雜交組合‘紫鳳羽ב花王的結實蓇葖果數最多（8個），雖其每果不飽滿種子數也最多，但每果仍約有9粒飽滿種子，因此其收獲的飽滿種子最多。‘矮粉1號ב層中笑的結實蓇葖果數也較多（6個），但其每果飽滿種子數平均僅2.57粒，因此該雜交組合收獲的飽滿種子數較少。而‘紫鳳羽ב月宮燭光雖僅有2個結實蓇葖果，但其每果飽滿種子數最多，達到平均16.50粒，最終該組合收獲的飽滿種子數明顯多于‘矮粉1號ב層中笑組合。根據百粒重，‘紫鳳羽為母本的3個定向雜交組合均高于其自然結實，而‘矮粉1號為母本的雜交組合‘矮粉1號ב層中笑百粒重略低于‘矮粉1號自然結實百粒重。每果結實心皮率，4個較優的雜交組合為 ‘矮粉1號ב層中笑（7368%）、‘紫鳳羽ב層中笑（60.00%）、‘紫鳳羽ב月宮燭光（52.50%）、‘紫鳳羽ב花王（47.06%）。

2.4 芍藥與牡丹雜交種子發育觀測

根據12個雜交組合收獲時的蓇葖果發育狀態，我們發現形成飽滿種子的蓇葖果中，雖然不同雜交組合飽滿種子與不飽滿種子數量存在差異，但所有種子外種皮均變為褐色，且蓇葖果內未見黏液存在（圖3）。

未形成種子的則主要有兩種類型：多數敗育組合的蓇葖果心皮膨大，正常發育，但蓇葖果內胚珠未發育，并且在收獲時蓇葖果心皮內仍有未干黏液存在（圖4A），可能是胚珠未受精成功;還有一些蓇葖果內有少數胚珠發育膨大，但是未發育形成飽滿種子，雖外種皮變為褐色，但是種皮凹陷皺縮，干扁，剝開后發現內空，明顯敗育，蓇葖果心皮內未見黏液（圖4B）。

3 討論與結論

盡管我國是芍藥屬植物的主要原產地[9，10]，但國外對于芍藥新品種的培育卻遠遠領先于我國，其重要原因之一就在于雜交育種時設計親本組合的廣泛程度遠遠超過我國[11]。本研究通過對12個芍藥與牡丹雜交組合結實性的調查分析，篩選出4個結實性較高的遠緣雜交組合，為進一步開展芍藥屬植物雜交育種實踐提供了種質材料。

前人在選擇芍藥母本時常用單瓣型的‘粉玉奴[12，13]，郝青等發現并鑒定的我國第一例伊藤雜種‘和諧就是以‘粉玉奴為母本材料培育出的[14]。但‘粉玉奴自然狀態下結實率較低[7]。本試驗選用的4個芍藥品種在自然授粉情況下結實率相對較高（19～41粒/果），但在與牡丹進行遠緣雜交時，即使父本相同，[JP2]其結實情況也明顯不同，例如在以‘層中笑為父本的雜交組合中，根據獲得飽滿種子的數量，其排序依次為‘矮粉1號ב層中笑（18）>‘紫鳳羽ב層中笑（12）>‘迷你ב層中笑（1）>‘鳳凰涅槃ב層中笑（0）。[JP]‘鳳凰涅槃在自然授粉結實情況下的所有結實特性指標均高于其他3個芍藥品種，但與3個牡丹品種的雜交組合中，授粉75朵花，卻只收獲到1粒成熟飽滿種子。通過對‘鳳凰涅槃開花進程的觀察，發現其存在花粉早熟現象，即花苞尚未開放前，花粉已經成熟散粉，并且花柱頭分泌黏液也較早，花朵開放2～3天即大量分泌黏液，說明‘鳳凰涅槃存在雌雄蕊雙重早熟的特性，這些因素可能導致了其人工雜交不親和、結實率低。

父本花型和花粉活力是雜交親和性和結實率的重要影響因素，選擇花粉活力較高的父本能顯著提高結實率[15，16]。本研究的3個父本牡丹品種分屬于中原牡丹品種群、日本牡丹品種群和紫斑牡丹品種群，花粉活力均大于60%，分別為8843%（‘層中笑）、8848%（‘花王）、65.57%（‘月宮燭光），但與芍藥雜交后的結實率并不呈正相關。例如，以‘紫鳳羽為母本的雜交組合中，按照結實率由高到低的順序，其父本依次是‘月宮燭光、‘層中笑、‘花王。這種不一致性充分表明，在父本花粉活力超過60%的前提下，雜交組合的結實率高低與父本花粉活力沒有必然關聯。

芍藥與牡丹親緣關系較遠[17]，雜交時往往存在雜交障礙，可能是受精前障礙，也可能是受精后障礙，或者二者兼而有之，均影響其結實性[18，19]。為判斷雜交障礙類型，以往研究往往采用熒光顯微觀測法或石蠟切片法，前者授粉后72小時內定期取樣，后者則在授粉后到種子成熟期間定期取樣[7]，不僅繁瑣，而且浪費了大量寶貴的雜交組合材料。本研究在種子成熟時取樣觀測，并結合結實特性數據，可基本判定不同雜交組合的主要不親和類型，例如圖4所示的3個雜交組合中，‘矮粉1號ב花王和‘鳳凰涅槃ב花王組合均屬于受精前障礙，而‘鳳凰涅槃ב層中笑則屬于雙重障礙。針對不同原因造成的雜交結實特性弱的問題，今后在開展相關雜交時可以有意識地采用相應措施予以預防，如針對受精后障礙，可采取幼胚拯救培養法，而針對受精前障礙，則可嘗試柱頭切割、花粉蒙導等方法。

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