灰葡萄孢Bctre1的基因組定位、蛋白質結構預測及表達分析

沈彥輝　陳宏坤　高璐陽　徐廣飛　付強強

摘要：本研究選取灰葡萄孢菌株BC 05.10為試材，克隆Bctre1基因的核苷酸序列并對其進行生物信息學分析，同時采用熒光定量PCR法研究該基因在不同侵染時期、分生孢子萌發過程中以及不同碳源、海藻糖誘導下的表達情況。結果表明：該基因ID號為5428296，全長3 341 bp，位于scaffold_17負鏈的495 880～499 211位置，與核盤菌Sstre1的同源關系較近; BcTRE1蛋白由1 033個氨基酸殘基編碼組成，該蛋白N端具有2個6發卡結構的超糖苷酶家族和1個C端糖基水解酶家族63。熒光定量PCR結果顯示，隨著侵染時間的延長Bctre1表達量顯著增加（P<0.05），48 h后表達量增加不顯著;Bctre1在分生孢子萌發24 h時表達量最高;Bctre1在海藻糖為單一碳源的培養基中表達量最高，在海藻糖誘導下12 h 后Bctre1表達量顯著增加（P<0.05）。綜上，Bctre1與侵染寄主過程中分生孢子萌發及不同碳源利用密切相關，在侵染后期對促進菌絲生長發揮重要作用。

關鍵詞：灰葡萄孢;Bctre1;基因組定位;蛋白結構;表達分析

中圖分類號：S432.4+4：Q78文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）03-0013-06

Abstract In this study， the Botrytis cinerea ?strain BC 05.10 was selected as test material， and the nucleotide sequence of Bctre1 gene were cloned and analyzed by bioinformatics method. The expression of Bctre1 gene at different infection stages， in the process of conidia germination， and under different carbon sources and trehalose induction were studied by fluorescence quantitative PCR method. The results showed that the gene ID number was 5428296， and its total length was 3 341 bp， which was located at 495 880～499 211 sites of the negative chain of scaffold_17. The homologous relationship between Bctre1 and Sstre1 was close. The protein encoded by Bctre1 gene contained 1 033 amino acid residues and had two 6-hairpin structure super glucosidase family and one C-terminal glycosyl hydrolase family 63. The results of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of Bctre1 increased significantly with the increase of infection time （P<0.05）， while the increase of Bctre1 expression after 48 h was not significant. The expression of Bctre1 was the highest when conidia germinated for 24 h and the trehalose was used as the single carbon source in medium， and it increased significantly after 12 h under trehalose induction （P<0.05）.In summary， Bctre1 was closely related to conidia germination and different carbon source utilization during the process of infecting host， and played an important role in promoting mycelial growth at late stage of infection.

Keywords Botrytis cinerea; Bctre1; Genome location; Protein structure; Expression analysis

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染寄主廣泛，有遺傳變異大、繁殖快、侵染性強等特點。它已對多種殺菌劑產生抗藥性，但農業生產中為防止灰霉病的發生，大多采用加大殺菌劑使用量的方法，這對農產品的安全性造成了嚴重威脅[1，2]。海藻糖是一種普遍的儲藏性糖類， 有研究表明，其參與真菌的生長發育、代謝反應、逆境脅迫、產孢和致病力等途徑[3-6]。海藻糖酶（trehalase，Tre）能抑制海藻糖合成，當真菌體內的海藻糖含量降低時，其生長發育與致病性均受到影響。例如，海藻糖酶能抑制假絲酵母和稻瘟病菌在寄主體內的存活[3]。黑曲霉缺失treB基因可使分生孢子發育受限和致病力下降[7]。白色念珠菌缺失treB基因可導致致病力下降[4]。Foster等[8]研究結果表明，稻瘟病菌（Magnaprothe grisea）中編碼中性海藻糖酶的基因NTH1突變會引起病菌在寄主組織內擴展能力下降，導致致病力下降。Doehlemann等[9]認為海藻糖酶基因不影響灰葡萄孢的致病力，但可以調控孢子的萌發率和影響孢子的熱耐受能力，tre基因缺失突變體孢子萌發率下降[9]。

當前，昆蟲、線蟲和動物寄生線蟲海藻糖酶基因的研究取得一系列進展，但關于植物病原真菌海藻糖酶基因的研究相對較少。本試驗擬利用同源克隆技術獲得Bctre1基因，采用軟件對其結構特征進行分析，用實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測不同侵染時期、分生孢子萌發過程及不同碳源、海藻糖誘導下Bctre1的表達情況，旨在為研究灰葡萄孢Bctre1基因在其生長、發育及侵染過程的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 灰葡萄孢（Botrytis cinerea）野生型菌株BC 05.10由養分資源高效開發與綜合利用國家重點實驗室保存。

1.1.2 供試培養基 PDA培養基：200 g馬鈴薯切碎加蒸餾水煮30 min后過濾，濾液加入20 g葡萄糖、15 g瓊脂，加水定容至1 L。水瓊脂培養基：瓊脂12 g，加水定容至1 L。改良Fries培養基：蔗糖30 g、酒石酸胺5 g、NaCl 0.1 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO4 1 g、NH4NO3 1 g、MgSO4 0.5 g、酵母浸膏0.5 g、瓊脂12 g，加水定容至1 L。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）、反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser）、Real-Time PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）均購于TaKaRa公司。凝膠成像系統，北京賽創科技有限公司產品;紫外分析儀，北京新技術應用研究所產品;DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀，北京市六一儀器廠產品;TGL-16G型離心機，上海安亭科學儀器廠產品;SPX-250B-Z型生化培養箱，上海博迅實業有限公司產品;CFX96 Real-Time PCR Detection System，美國BIO-RAD公司產品）。

1.3 Bctre1的生物信息學分析用RNA提取試劑盒提取灰葡萄孢基因組的RNA，以反轉錄得到的cDNA為模板進行，利用Primer Premier 5.0軟件設計Bctre1的擴增引物（Bctre1-F：5′-TCACATCTTCCATCTACGACGA-3′;Bctre1-R：5′-TCCATGAGACTTTACAAACCAGA-3′）。擴增體系 （25 μL）： cDNA模板2.0 μL，2.5 μmol/L dNTP ?10.0 μL， 10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，ddH2O 9.8 μL。擴增程序： 95℃預變性5 min; 95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環35次;72℃終延伸 10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

通過Blast搜索Botrytis cinerea基因組數據庫（JGI，https：//genome.jgi.doe.gov/Botci1/Botci1.home.html），確定Bctre1在基因組中的精確位置。利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹。利用在線軟件ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析核酸及氨基酸序列、蛋白質理化性質。利用在線軟件InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對BcTRE1蛋白的功能域進行預測。分別利用SOMPA和Phyre 2軟件分析和預測BcTRE1蛋白的二級結構和三維結構[10-13]。

1.4 灰葡萄孢病菌侵染過程中Bctre1的表達分析

將灰葡萄孢病菌BC 05.10接種于PDA平板上，23℃暗培養3 d。采用直徑為1 cm的打孔器自PDA培養基上制取菌餅，保濕24～72 h后接種大豆葉片，并分別于接種后0、6、12、24、48、72 h剪取80～100 mg菌餅下方的大豆葉片，液氮速凍，-80℃保存備用。以18S rRNA作為內參基因，Real-Time PCR所用引物同1.3，均由上海生工生物工程有限公司合成。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取灰葡萄孢病菌不同侵染時期樣品的RNA，采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行cDNA的合成。美國伯樂公司CFX96熒光定量PCR儀，以不同侵染時期的cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行Real-Time PCR擴增。擴增體系（25 μL）：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95℃ 30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s，40個循環;95℃ 5 s;60℃ 30 s。每個樣品技術性重復4次，生物學重復3次。

1.5 灰葡萄孢病菌分生孢子萌發過程中Bctre1的表達分析

把玻璃紙置于水瓊脂上，然后將灰葡萄孢菌株BC 05.10接種到該平板置于26℃暗培養，分別收集6、12、18、24 h的分生孢子，提取不同萌發時期分生孢子RNA，并進行cDNA的合成。檢測不同階段的表達規律，方法同1.4。

1.6 不同碳源培養下Bctre1的表達分析

將灰葡萄孢病菌菌株BC 05.10培養于改良的固體Fries培養基，分別將碳源換成1%的葡萄糖、海藻糖、蔗糖、果膠和甘油，26℃暗培養4 d，收集菌絲提取RNA，反轉錄成cDNA。Bctre1表達情況的檢測方法同1.4。

1.7 海藻糖誘導下Bctre1的表達分析

將灰葡萄孢病菌菌株BC 05.10培養于改良的固體Fries培養基，將碳源換成1%的海藻糖，以不加碳源為對照，26℃暗培養4 d，收集菌絲提取RNA，反轉錄成cDNA。采用Real-Time PCR方法檢測Bctre1表達情況，方法同1.4。

1.8 數據處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進行數據整理并作圖，用SAS 8.1軟件中Turkey法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 Bctre1的生物信息學分析

2.1.1 Bctre1基因cDNA編碼區的克隆 以反轉錄合成的 cDNA為模板，以Bctre1-F和Bctre1-R為引物，PCR擴增結果如圖1所示，目的片段約為3 300 bp，與預期結果相符。膠回收目的片段測序后，可得Bctre1 cDNA長度為3 332 bp。

2.1.2 Bctre1在基因組中的定位 以前期擴增到的Bctre1基因序列為探針序列，利用Blastn搜索灰葡萄孢基因組數據庫，得到基因ID號為5428296，基因全長3 341 bp，位于scaffold_17負鏈的495 880～499 211位置。

2.1.3 系統發育分析 利用MEGA 4.0軟件對Bctre1與核盤菌、柄孢霉的tre1核苷酸序列進行系統發育分析，可知，Bctre1與核盤菌Sstre1同源關系較近（圖2）。

2.1.4 理化性質分析 BcTRE1蛋白含有1 033個氨基酸殘基，分子量為120 195.19，理論等電點5.48，預測該蛋白280 nm處的吸光度為2.035～2.031，不穩定系數為43.26，平均疏水性為-0.769。

2.1.5 保守功能域分析 BcTRE1蛋白序列在線分析結果表明，其N端有2個6發卡結構的超糖苷酶家族，分別位于398～674、723～902氨基酸殘基位置。其中723～812氨基酸殘基位置還有1個C端糖基水解酶家族63（圖3）。

2.1.6 BcTRE1蛋白二級結構預測 BcTRE1蛋白的二級結構分析結果表明，該蛋白中無規則卷曲的含量為48.23%，由423個氨基酸殘基構成;α-螺旋的含量為41.82%;β-折疊含量較少，占15.85%;β-轉角含量最少，僅占8.32%（圖4）。

2.2 Bctre1表達特性分析

2.2.1 不同侵染時期Bctre1的表達特性 由圖5可以看出，一定范圍（0～48 h）內，隨著侵染時間的延長，Bctre1基因的表達量顯著增加;72 h時，表達量雖有增加，但與48 h的相比未達顯著水平。這可能是由于侵染48 h后，灰葡萄孢病菌體內的海藻糖酶含量達到臨界點，產生的海藻糖酶用于清除體內多余的海藻糖造成的。

2.2.2 灰葡萄孢分生孢子生長過程中tre1基因的表達規律 Bctre1基因表達量隨培養時間延長升高明顯（圖6），表明Bctre1基因的表達量與灰葡萄孢分生孢子生長呈正相關，推測Bctre1基因參與灰葡萄孢分生孢子萌發侵染過程。

2.2.3 不同碳源培養下Bctre1的表達分析 由圖7可以看出，Bctre1基因表達量在以海藻糖為碳源的培養基中最高，約是以葡萄糖為碳源的培養基中表達量的2倍。這可能是Bctre1基因將海藻糖分解成兩分子葡萄糖造成的，說明Bctre1基因促進海藻糖的分解， 葡萄糖與灰葡萄孢的生長發育有關。Bctre1基因在果膠培養基中的表達量與在葡萄糖培養基中的差異不顯著（P>0.05），表明Bctre1在一定程度上能將果膠轉化為灰葡萄孢可利用的糖源物質。甘油培養基中的Bctre1表達量最低，這可能是由于葡萄孢不能將甘油轉化成其可利用的糖源物質的緣故。

2.2.4 海藻糖誘導下Bctre1基因的表達分析

[JP2]由圖8可以看出，海藻糖誘導的Bctre1基因表達量高于未誘導，處理12 h后，差異達顯著水平（P<0.05），[JP]24 h時表達量最高。結合2.2.1和2.2.2中Bctre1基因的表達規律，得出海藻糖可能與灰葡萄孢及其分生孢子的侵染有關。

3 討論與結論

本研究通過PCR擴增得到Bctre1 基因，并運用生物信息學技術確定該基因位于灰葡萄孢基因組scaffold_17負鏈的495 880～499 211位置，全長為3 341 bp。通過核苷酸同源性分析發現，Bctre1與Sstre1同源關系較近。Bctre1的基因保守結構分析結果表明，該蛋白的N端有2個6發卡結構的超糖苷酶家族，分別位于398～674、723～902氨基酸殘基位置，其中723～812氨基酸殘基位置還有1個C端糖基水解酶家族63。

植物病原真菌中tre1的功能已有報道。Petitjean等[4]研究發現，白色念珠菌（Candida albicans）的tre基因與致病力有關，敲除tre基因后其致病力下降。Svanstrm等[7]研究發現，黑曲霉（Aspergillus niger）中treB基因與分生孢子的產生和海藻糖酶有關，treB突變菌株分生孢子梗只能產生少數有活力的分生孢子，而且不能降解分生孢子萌發過程中的胞內海藻糖。本研究發現， Bctre1在菌絲侵染后期和分生孢子生長后期表達量最大，表明tre1基因在灰葡萄孢侵染時發揮重要作用。本研究還發現，不同碳源培養基上Bctre1基因的表達量不同，其在海藻糖培養基中表達量是葡萄糖培養基中的2倍，因此，脅迫條件下灰葡萄孢利用tre1基因將海藻糖分解成葡萄糖，為其生長提供糖源。此外，海藻糖誘導情況下， Bctre1基因表達量顯著增加，而此階段的菌絲生長速率也較快，這可能與灰葡萄孢及其分生孢子的侵染有關。本試驗初步證實了海藻糖酶與灰葡萄孢的菌絲和分子孢子生長發育的關系，證實Bctre1在灰葡萄孢侵染過程中發揮作用。但若要深入了解該基因的功能和機制，還需要從基因水平和蛋白質水平進行功能研究，探究其在灰葡萄孢生長、發育及侵染過程中的具體作用機制。

綜上所述，Bctre1基因受灰葡萄孢生長發育和逆境脅迫因子誘導表達，推測其可能是調控灰葡萄孢侵染寄主及侵染后菌絲生長的關鍵基因。

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