大白菜GID1家族基因鑒定及表達(dá)模式分析

宋晴晴　張慧敏　張燁　張一卉　李景娟　李化銀　賀立龍　王鳳德　高建偉

摘要：大白菜是我國分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物，其豐產(chǎn)對安定人民生活起著舉足輕重的作用。GID1蛋白是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要受體，在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用生物信息學(xué)分析方法對大白菜基因組中GID1家族基因進(jìn)行鑒定，并對該基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、系統(tǒng)進(jìn)化以及表達(dá)模式等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大白菜基因組中含有5個GID1家族成員，分別位于4、5、6、7、9號染色體上，各家族成員都只含有1個內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，單子葉和雙子葉植物的GID1蛋白明顯處于兩個不同分支，大白菜GID1家族成員與擬南芥GID1具有更近的親緣關(guān)系。通過表達(dá)模式以及啟動子順式響應(yīng)元件分析發(fā)現(xiàn)，大白菜GID1基因不僅參與生長發(fā)育調(diào)控還可能參與對不同環(huán)境因子的響應(yīng)過程。

關(guān)鍵詞：大白菜;GID1基因;生物信息學(xué)分析;表達(dá)模式分析

Abstract： Chinese cabbage is the vegetable with the widest distribution and the largest planting area in China. Its yield plays an important role in the stability of the people's life. GID1 protein is an important receptor in the process of gibberellin signal transduction and plays an important role in regulating plant growth and development. In this study， the GID1 family genes in the Chinese cabbage genome were identified by bioinformatics methods， and their gene structure， chromosome distribution， phylogenetics and expression patterns were analyzed. The results showed that the Chinese cabbage genome contained 5 GID1 gene members and was evenly distributed on chromosomes 4， 5， 6， 7 and 9. In addition， members of the Chinese cabbage GID1 family contain only one intron. In phylogenetic evolution， the GID1 family of proteins has distinct branches between dicotyledons and monocotyledons， while the GID1 family members of Chinese cabbage have a closer genetic relationship with Arabidopsis GID1. Through expression pattern and promoter cis-element analysis， it was found that the GID1 gene of Chinese cabbage not only participates in the regulation of growth and development but also may participate in the response process to different environmental factors. This study not only provides clues for us to understand the function of GID1 gene in Chinese cabbage， but also provides an important reference for further application in molecular breeding of Chinese cabbage.

Key words： Chinese cabbage; GID1 gene;Bioinformatics analysis; Expression pattern analysis

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）起源于中國，常年種植面積2×106 hm2左右，總產(chǎn)約1億噸，是種植面積、產(chǎn)量最大的蔬菜作物，素有“國菜”之稱。長期生產(chǎn)實踐表明，大白菜產(chǎn)量與葉球大小直接相關(guān)并且受嚴(yán)格的遺傳控制。因此，挖掘參與調(diào)控大白菜葉球大小的相關(guān)基因?qū)⒉粌H有助于闡明葉球發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，還有助于通過分子輔助育種手段提高大白菜產(chǎn)量。

赤霉素（gibberellin， GA）作為一種重要的植物激素，參與調(diào)控植物生長和發(fā)育，如種子萌發(fā)、植株生長、花器官形成以及果實發(fā)育等[1，2]。GID1（GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF1）蛋白是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要受體，能特異性地結(jié)合活性GA，并進(jìn)一步與DELLA蛋白結(jié)合形成復(fù)合體[3，4]。而這個復(fù)合體可以被特定的泛素E3連接酶復(fù)合體（SCFSLY1/GID2）多聚泛素化后被26S蛋白酶降解，從而產(chǎn)生GA效應(yīng)[5]。2005年，人們在水稻中首次發(fā)現(xiàn)GID1蛋白，gid1-1突變體表現(xiàn)為植株矮化，對GA不敏感[6]。Nakajima等[7]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組存在GID1a、GID1b和GID1c三個成員，進(jìn)一步研究[8]表明，三個成員中任何一個發(fā)生功能缺失突變對植株表型幾乎沒有影響，但同時發(fā)生功能缺失突變則可導(dǎo)致植株極其矮小，對GA完全不敏感。最近，Illouz-Eliaz等[2]發(fā)現(xiàn)另一種模式植物番茄基因組中也存在三個GID1成員，同樣是在三者同時發(fā)生功能缺失時出現(xiàn)植株極其矮小的表型，從而說明GID1不同成員間存在功能冗余。然而，Cheng等[9]對桃樹兩個GID1成員的研究發(fā)現(xiàn)，一個基因（GID1c）發(fā)生突變即可導(dǎo)致植株矮小。因此，對于不同植物而言，GID1成員在調(diào)控生長發(fā)育的過程中存在一定分化，并且GID1基因在調(diào)控植物大小的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。但目前尚未見關(guān)于大白菜GID1基因的研究報道。

基于上述分析，本研究首先在大白菜全基因組水平上對GID1家族基因進(jìn)行鑒定，后對其在染色體上的分布、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化以及表達(dá)模式等進(jìn)行分析，以期了解GID1基因功能，并為其在大白菜分子育種中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1 大白菜GID1基因鑒定

本研究從擬南芥基因組網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/）下載了擬南芥GID1家族成員的蛋白序列，并以其為探針分別在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和大白菜基因組網(wǎng)站（http：//brassicadb.org/brad/）上進(jìn)行BLAST檢索。提取最優(yōu)比對結(jié)果，然后利用在線軟件SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de）對候選基因進(jìn)一步驗證，確保其含有HGG和GXSXG蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy Proteomics Server 工具（http：//www.expasy.org/tools）中提供的ProtParam軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子蛋白的分子量、理論等電點分析，GSDS軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析內(nèi)顯子/外含子結(jié)構(gòu)，MEME軟件（http：//meme.nbcr.net/meme/）分析保守基序（Motif），SMART 軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de）分析保守結(jié)構(gòu)域，DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對分析，MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，MapChart軟件進(jìn)行染色體分布分析，PlantCARE軟件（http：//bioinform-atics.psb.ugent.be/webtools/pla-ntcare/html/）進(jìn)行啟動子區(qū)順式作用元件分析。

番茄、水稻和玉米GID1家族成員的氨基酸序列下載自Phytozome基因組網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.3 大白菜GID1基因表達(dá)模式分析

參照Tong等[10]的數(shù)據(jù)對BrGID1基因在大白菜根、莖、葉、花以及角果中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，RPKM值取對數(shù)值后利用TBtools軟件繪制熱圖。

不同葉位葉片BrGID1基因表達(dá)模式分析所用大白菜品種為西白16（山東登海種業(yè)股份有限公司西由種子分公司產(chǎn)品）和夏綠50（香港惟勤企業(yè)有限公司）。其中，成熟期，西白16植株較大，整株重約7 kg，而夏綠50較小，重約1.5 kg。選取飽滿一致的種子播于盛滿營養(yǎng)土的方形塑料盆（7 cm×7 cm）中。待幼苗長至第2片真葉完全展開時，向葉片正反面噴灑100 μmol/L GA3，以噴水為對照（CK），并在處理后0、1、3 h采集第1片真葉進(jìn)行表達(dá)模式分析。待長至5葉期時（第5片葉完全展開），按從下到上的順序選取第1、3、5片葉作為樣品進(jìn)行表達(dá)模式分析。

本研究使用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒（目錄號：DP432）提取RNA，寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScript？ RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（目錄號：RR047A）合成cDNA、TB Green？ Fast qPCR Mix試劑盒（目錄號：RR430A）進(jìn)行熒光實時定量PCR（RT-qPCR）。熒光實時定量PCR所用引物如表1所示，每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，利用2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)水平，再使用TBtools軟件繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1大白菜GID1基因家族成員鑒定

本研究利用相關(guān)軟件對候選基因進(jìn)一步驗證發(fā)現(xiàn)，大白菜基因組中存在5個GID1家族基因。將這5個GID1基因與擬南芥GID1基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)Bra039460與AtGID1a基因在同一分支，Bra040420、Bra003520和Bra007722與AtGID1b基因在同一分支，而Bra009970則與AtGID1c基因位于同一分支（圖1A）。因此，參照擬南芥GID1基因家族的命名方法并進(jìn)一步根據(jù)5個基因在染色體上的相對位置（圖1B），分別將其命名為BrGID1a、BrGID1b1、BrGID1b2、BrGID1b3和BrGID1c。利用GSDS軟件對大白菜GID1基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，5個成員均只含有一個內(nèi)含子（圖1C）。另外，對大白菜GID1家族基因不同成員進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其CDS序列長度介于1038～1191 bp，預(yù)測編碼蛋白長度在345～396aa之間，分子量在38503.73～44301.5 Da之間，等電點在6.21～6.79之間（表2）。

A：大白菜和擬南芥GID1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析;B：大白菜GID1基因在染色體上的位置分布;C：大白菜GID1基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析（標(biāo)尺代表基因長度，綠色部分代表外顯子區(qū)域，橫線部分代表內(nèi)含子）。

2.2大白菜GID1蛋白保守基序分析

利用在線分析軟件MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/）對大白菜GID1家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，共得到10個Motif（保守基序）（圖2）。其中Motif1、2、4、5、6、7、9同時存在于5個BrGID1蛋白，Motif10存在于BrGID1a和BrGID1c中，而Motif3、8則僅存在于BrGID1b1、BrGID1b2和BrGID1b3中。因此，本研究推測Motif1、2、4、5、6、7、9可能是維持BrGID1家族蛋白基本功能所必需的，而其它保守結(jié)構(gòu)域在不同成員上的差異分布則可能是導(dǎo)致不同成員功能差異的原因。

此外，通過對大白菜GID1家族蛋白進(jìn)行多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，它們的氨基酸序列一致性為73.67%，但均具有保守的激素敏感性脂肪酶活性的HGG和GXSXG結(jié)構(gòu)域（圖3）。Hirano等[11]研究表明，擬南芥GID1蛋白與GA或DELLA的蛋白結(jié)合區(qū)有13個結(jié)合功能域，從N端到C端依次是TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、WYW和GFY。而對大白菜BrGID1蛋白分析發(fā)現(xiàn)，BrGID1b3蛋白TWVLIS結(jié)構(gòu)域中的L被F取代，BrGID1a蛋白GNI結(jié)構(gòu)域中的I被V取代，其它區(qū)域則都是保守的。以上結(jié)果表明，大白菜BrGID1蛋白在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要功能的氨基酸殘基與模式植物一樣都是保守的，它們在GA作用機(jī)制中的受體功能可能是完整的。

[2]Illouz-Eliaz N， Ramon U， Shohat H， et al. Multiple gibberellin receptors contribute to phenotypic stability under changing environments[J]. Plant Cell， 2019， 31（7）： 1506-1519.

[3]Hedden P. Gibberellins close the lid[J]. Nature， 2008， 456： 455-456.

[4]Sun T P. Gibberellin metabolism， perception and signaling pathways in Arabidopsis[J]. Arabidopsis Book， 2008， 6（1）： 1-28.

[5]Sun T P. Gibberellin-GID1-DELLA： a pivotal regulatory module for plant growth and development[J]. Plant Physiology， 2010， 154（2）： 567-570.

[6]Ueguchi-Tanaka M， Ashikari M， Nakajima M， et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin[J]. Nature， 2005， 437： 693-698.

[7]Nakajima M， Shimada A， Takashi Y， et al. Identification and characterization of Arabidopsis gibberellin receptors[J]. Plant J.， 2006， 46（5）： 880-889.

[8]Griffiths J， Murase K， Rieu I， et al. Genetic characterization and functional analysis of the GID1 gibberellin receptors in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2006， 18（12）： 3399-3414.

[9]Cheng J， Zhang M M， Tan B， et al. A single nucleotide mutation in GID1c disrupts its interaction with DELLA1 and causes a GA-insensitive dwarf phenotype in peach[J]. Plant Biotechnology Journal， 2019， 17（9）： 1723-1735.

[10]Tong C， Wang X W， Yu J Y， et al. Comprehensive analysis of RNA-seq data reveals the complexity of the transcriptome in Brassica rapa[J]. BMC Genomics， 2013， 14： 689.

[11]Hirano K， Nakajima M， Asano K， et al. The GID1-mediated gibberellin perception mechanism is conserved in the lycophyteSelaginella moellendorffii but not in the bryophyte Physcomitrella patens[J]. Plant Cell， 2007， 19（10）： 3058-3079.

[12]The Brassica rapa Genome Sequencing Project Consortium， Wang X， Wang HZ， et al. The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J]. Nat. Genet.， 2011， 43（10）： 1035-1039.

[13]Cheng F， Mandáková T， Wu J， et al. Deciphering the diploid ancestral genome of the mesohexaploid Brassica rapa[J]. Plant Cell， 2013， 25（5）： 1541-1554.

[14]Tanaka N， Matsuoka M， Kitano H， et al. gid1， a gibberellin-insensitive dwarf mutant， shows altered regulation of probenazole-inducible protein （PBZ1） in response to cold stress and pathogen attack[J]. Plant Cell and Environment， 2006， 29（4）： 619-631.

[15]Chen L， Cao T， Zhang J， et al. Overexpression of OsGID1enhances the resistance of rice to the brown planthopper Nilaparvata lugens[J]. Int. J. Mol. Sci.， 2018， 19（9）：2744.

[16]Ariizumi T， Murase K， Sun T P， et al. Proteolysis-independent downregulation of DELLA repression in Arabidopsis by the gibberellin receptor GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1[J]. Plant Cell， 2008， 20（9）： 2447-2459.

[17]Powell A E， Lenhard M. Control of organ size in plants[J]. Current Biology， 2012， 22（9）： R360-R367.