雙水相法制備鱖魚（Siniperca chuatsi）肌動(dòng)蛋白及定量分析

王洋洋，徐明芳,*，白衛(wèi)濱，鄭春麗，葉 蕾，鄭琴琴

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632）

鱖魚（Siniperca chuatsi）俗稱翹嘴鱖、桂花魚、桂魚等，隸屬鱸形目、鮨科，為我國特有的淡水肉食性兇猛魚類，在中國分布極為廣泛，除青藏高原外，南北水系中均有出產(chǎn)，廣泛分布于中東部的江河、湖庫中。鱖魚肉質(zhì)純白細(xì)嫩、味道鮮美可口，是我國重要的名貴經(jīng)濟(jì)魚類，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，有“淡水石斑”之稱[1]，是進(jìn)行魚類肌肉品質(zhì)評價(jià)研究的良好材料。魚肉主要由蛋白質(zhì)和脂肪構(gòu)成，魚類肌肉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)18%～22%，高于豬肉（20.2%）、牛肉（19.8%）、羊肉（15.5%）等禽類的蛋白質(zhì)含量[2]。魚類肌肉中的肌原纖維蛋白約占總蛋白質(zhì)的55%～60%，是魚肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)[3]，適宜的加工處理可以使其形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而賦予肉制品良好的凝膠特性和感官特性[4]，主要包括起收縮作用的肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白等[5]，其中肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的含量分別約占肌原纖維蛋白的20%和50%～55%[3]。肌漿蛋白占總蛋白質(zhì)的25%～35%，主要包括肌白蛋白、球蛋白和酶類等多種蛋白質(zhì)[6]；基質(zhì)蛋白是結(jié)締組織蛋白質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為10%～15%[7]，包括膠原蛋白、網(wǎng)狀蛋白及黏蛋白等；肌動(dòng)蛋白是所有真核細(xì)胞中高度保守的豐富蛋白質(zhì)[8-9]，單體肌動(dòng)蛋白分子質(zhì)量約為42 kDa，由375～377 個(gè)氨基酸組成。在肌肉細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白細(xì)絲參與肌肉收縮。在非肌細(xì)胞中，肌動(dòng)蛋白通過單體（G-肌動(dòng)蛋白）和聚合體（F-肌動(dòng)蛋白）形式之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞分裂、黏附、運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸[10]。在肉制品中，肌動(dòng)蛋白不能單獨(dú)形成凝膠，但與肌球蛋白以一定比例結(jié)合可改變形成凝膠的能力，是影響肉糜及肉制品加工特性的主要特性蛋白質(zhì)[11]。肌動(dòng)蛋白的變性溫度顯著高于肌球蛋白，在肉制品凍藏過程中，肌動(dòng)蛋白比肌球蛋白更穩(wěn)定[12]。

目前，國內(nèi)外對肌動(dòng)蛋白提取研究主要包括王志峰等[13]的丙酮抽提-層析法、張秀真[14]的兩次層析法及Ebashi[15]的離心直提法，這些方法實(shí)驗(yàn)步驟多耗時(shí)，操作繁瑣溶劑消耗大。因此，建立一種高效快速分離肌動(dòng)蛋白方法對于名貴魚類品質(zhì)鑒定及營養(yǎng)功能與加工特性研究十分必要。雙水相萃取（aqueous two-phase system，ATPS）是一種新型的液-液萃取技術(shù)，對蛋白質(zhì)、酶、病毒、核酸、抗體、抗生素等生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物的提取、純化，具有處理時(shí)間短，條件溫和，生物活性物質(zhì)不失活、不變性，不存在有機(jī)溶劑殘留，易于工藝放大和連續(xù)操作，提取率高等優(yōu)點(diǎn)[16-18]，可以廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工和食品化工等領(lǐng)域。

肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度測定方法主要包括化學(xué)法如考馬斯亮藍(lán)法、雙縮脲法及光譜法等。Spudich[19]采用Lowry顯色法測定兔骨骼肌肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度，袁軍等[20]應(yīng)用雙波長薄層掃描分析確定凝膠電泳樣品中肌動(dòng)蛋白占總蛋白質(zhì)的相對百分含量，這些檢測方法反應(yīng)速度慢、易受干擾、定量結(jié)果偏差較大[21]。由于缺乏魚類肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，儀器精確定量檢測肌動(dòng)蛋白的研究鮮有報(bào)道，導(dǎo)致名貴魚類品質(zhì)屬性鑒定非常困難。毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法是一類以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離-分析方法，分離效率高（理論塔板數(shù)已達(dá)106～107/m）、消耗的溶劑或樣品體積小，可采用多種模式來改變選擇性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍，操作簡便，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等諸多優(yōu)點(diǎn)[22]，廣泛用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的多維分離與分析，以其快速高效的特點(diǎn)對于蛋白質(zhì)的定量檢測具有突出的優(yōu)越性[23-25]。

本實(shí)驗(yàn)采用雙水相體系分離肌原纖維蛋白中的肌動(dòng)蛋白，通過高聚物-無機(jī)鹽雙水相體系與低分子有機(jī)物-無機(jī)鹽雙水相體系成相能力分析，建立雙水相分離純化鱖魚肌動(dòng)蛋白的方法，基于高效毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）耦合二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD），探索MECC-DAD法定量檢測鱖魚肌動(dòng)蛋白的新方法，以期為名貴魚類質(zhì)量品質(zhì)屬性的鑒定奠定基礎(chǔ)，為肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的研制與大規(guī)模制備提供一種新的思路，為魚類蛋白功能開發(fā)利用及快速定量檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 尾齡鮮活鱖魚購自暨南大學(xué)菜市場，養(yǎng)殖體質(zhì)量（450±50）g，體長（25.2±0.5）cm，體高（8.1±0.5）cm，體質(zhì)健康。每次取背部肌肉20 g于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

兔肌動(dòng)蛋白（電泳純≥85%）、對乙酰氨基酚（色譜純≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；異丙醇、硫酸銨 天津大茂試劑廠；預(yù)染蛋白Marker（10、15、25、35、40、55、70、100、130、170 kDa） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲醇、無水乙醇、正丙醇、異丁醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（相對分子質(zhì)量600、2 000、4 000、6 000、10 000）、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、無水碳酸鈉、三水磷酸氫二鉀（簡稱磷酸氫二鉀）、考馬斯亮藍(lán)G-250等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Coulter P/ACETM MDQ型CE儀、毛細(xì)管柱（60 cm×75 μm，有效長度44 cm） 美國Beckman公司；CP224C型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV1750型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；HC-2518R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳儀器廠；Scientz-10N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-11型電腦三恒多用電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 雙水相相圖的制作

采用濁點(diǎn)法[26]繪制PEG-鹽和有機(jī)溶劑-鹽雙水相體系的相圖。

取一定量已知濃度的不同分子質(zhì)量的PEG于25 mL的燒杯中；向其中逐滴加入已知濃度的鹽溶液至混合溶液恰好出現(xiàn)渾濁，再滴加1 滴水，溶液馬上變得澄清；再多加1 滴鹽溶液，溶液又馬上渾濁，則可以判定該濁點(diǎn)為臨界點(diǎn)。重復(fù)上述操作，計(jì)算出濁點(diǎn)時(shí)溶液各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

取一定質(zhì)量的無機(jī)鹽（m1）加入一定量的蒸餾水（m2）；然后逐滴加入有機(jī)溶劑（m3）至混合溶液恰好出現(xiàn)渾濁，再滴加1 滴水，溶液馬上變得澄清；再多加1 滴有機(jī)溶劑，溶液又馬上渾濁，則可以判定該濁點(diǎn)為臨界點(diǎn)。重復(fù)上述操作，算出濁點(diǎn)時(shí)溶液各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算如下：

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參考Lv Mingchun[27]等的方法稍作修改，取剁碎的魚背部肌肉加入5 倍體積20 mmol/L Tris-馬來酸（含0.1 mol/L NaCl，pH 7.5）緩沖液，攪拌均勻，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，沉淀重復(fù)3 次。將最后一次的沉淀溶于10 倍體積20 mmol/L Tris-馬來酸（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.5）緩沖液，4 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液。將肌原纖維蛋白溶液用300 目尼龍網(wǎng)紗過濾，計(jì)算肌動(dòng)蛋白提取率時(shí)，調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白溶液的質(zhì)量濃度為（1±0.05）mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙水相分離肌動(dòng)蛋白有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽的確定[28]

取1 mL肌原纖維蛋白溶液，向其中加入不同類型的短鏈醇有機(jī)溶劑和不同分子質(zhì)量的PEG使之與磷酸氫二鉀形成雙水相。控制體系的總質(zhì)量為10.0 g，相比為1.0左右，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）選出僅能分離出肌動(dòng)蛋白單條帶的有機(jī)溶劑，計(jì)算肌動(dòng)蛋白的提取率確定最優(yōu)有機(jī)溶劑。

取1 mL肌原纖維蛋白溶液，向其中加入不同類型的無機(jī)鹽使之與異丙醇形成雙水相。控制體系的總質(zhì)量為10.0 g，相比為1.0左右，通過SDS-PAGE選出僅能分離出肌動(dòng)蛋白單條帶的無機(jī)鹽，計(jì)算肌動(dòng)蛋白的提取率確定最優(yōu)無機(jī)鹽。

式中：R為相比；Vt、Vb分別為上、下相體積/mL。

式中：c為上相肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；M為體系中肌原纖維蛋白的質(zhì)量/mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以肌動(dòng)蛋白提取率為評價(jià)指標(biāo)，分別考察異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（24%、26%、28%、30%、32%），硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（6%、8%、10%、12%、14%）、雙水相體系pH值（6、7、8、9、10）及肌原纖維蛋白加入量（10%、20%、30%、40%、50%）對肌動(dòng)蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和體系pH值為自變量，肌動(dòng)蛋白提取率為響應(yīng)值，按照Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used in Box-Behnken design

1.3.6 雙水相體系放大制備肌動(dòng)蛋白

雙水相體系放大500 倍，肌原纖維蛋白加入量分別為10%和30%，在異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%、pH 9.0的條件下放大，制備肌動(dòng)蛋白凍干粉。分離出上相經(jīng)過35 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，蒸餾水透析后凍干得到肌動(dòng)蛋白凍干粉。1.3.7 分析檢測

1.3.7.1 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[29]的方法，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，電極緩沖液含0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS。上樣量為15 μL；開始電泳時(shí)濃縮膠電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓改為120 V。電泳結(jié)束后，取出膠片用考馬斯亮藍(lán)染色，用無水乙醇-冰醋酸脫色至背景清晰。

1.3.7.2 蛋白質(zhì)量濃度的檢測

考馬斯亮藍(lán)法[30]測定蛋白質(zhì)量濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：取潔凈的試管，分別加入0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，依次加入蒸餾水補(bǔ)足體積至1 mL。各管加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻后室溫靜置5 min，在595 nm波長處測定吸光度。用1 mL蒸餾水作為空白對照，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5.81x+0.071，R2=0.999，線性關(guān)系良好，說明可用于肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度的測定。

1.3.7.3 肌動(dòng)蛋白純度鑒定[31]

將凍干粉復(fù)溶為1 mg/mL的蛋白溶液，通過分析型反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）進(jìn)行純度鑒定，色譜柱：反相C18柱；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃，檢測波長：214 nm。選用的流動(dòng)相為：A液（純水），B液（100%乙腈）。洗脫條件：0～5 min，0%～20% B；5～8 min，20%～40% B；8～15 min，40%～60% B；15～20 min，60%～20% B。肌動(dòng)蛋白純度按式（5）計(jì)算：

1.3.7.4 CE定量檢測肌動(dòng)蛋白

CE檢測條件A[23]：未涂層熔融石英毛細(xì)管柱，有效分離長度44 cm；DAD：檢測波長194 nm；CE壓力進(jìn)樣0.5 psi×5 s；電壓15 kV；分離溫度25 ℃。運(yùn)行緩沖液：10 mmol/L的四硼酸鈉、50 mmol/L的SDS溶液，鹽酸溶液調(diào)其pH 9.2。

CE檢測條件B[24]：未涂層熔融石英毛細(xì)管柱，有效分離長度44 cm；運(yùn)行緩沖溶液為20 mmol/L的PBS，pH 7.4，DAD：檢測波長214 nm，分離電壓10 kV，分離溫度25 ℃，CE壓力進(jìn)樣0.5 psi×5 s。

1.3.7.5 溶液配制

兔肌動(dòng)蛋白溶液：稱取0.001 1 g市售兔肌動(dòng)蛋白，運(yùn)行緩沖液溶解定容至0.5 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)；透析液進(jìn)樣溶液：取肌動(dòng)蛋白透析液0.5 mL，加入1 mL內(nèi)標(biāo)物對乙酰氨基酚（1 mg/mL），運(yùn)行緩沖液定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)；凍干粉進(jìn)樣溶液：凍干粉用運(yùn)行緩沖液復(fù)溶，取2 mL，加入1 mL內(nèi)標(biāo)物對乙酰氨基酚（1 mg/mL），運(yùn)行緩沖液定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)。

1.3.7.6 肌動(dòng)蛋白含量檢測

凍干粉復(fù)溶液，加入內(nèi)標(biāo)物對乙酰氨基酚后進(jìn)樣，記錄內(nèi)標(biāo)物和肌動(dòng)蛋白的峰面積，按式（6）計(jì)算肌動(dòng)蛋白含量：

式中：C為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；A1、A2分別為內(nèi)標(biāo)物和肌動(dòng)蛋白的峰面積；N為稀釋倍數(shù)；V為肌動(dòng)蛋白定溶體積/mL；M為肌動(dòng)蛋白凍干粉的質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度平行測定3 次，用Excel 2007計(jì)算，結(jié)果用表示。應(yīng)用Origin 8.5軟件繪制相圖、折線圖及MECC-DAD圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系的建立

2.1.1 3 種醇-鹽雙水相體系相圖

本實(shí)驗(yàn)研究了不同分子質(zhì)量的高聚醇PEG、小分子短鏈醇與磷酸氫二鉀，異丙醇與3 種鹽形成的雙水相體系，采用濁點(diǎn)法繪制雙水相體系的相圖分別如圖1～3所示。

圖1 PEG-磷酸氫二鉀體系相圖Fig. 1 Phase diagrams of PEG/K2HPO4 ATPS

由圖1可知，PEG 600與磷酸氫二鉀體系的分相能力最好，在PEG 600質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍5.4%～46%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍5.1%～24%均可以形成穩(wěn)定的雙水相。PEG 2 000～10 000與磷酸氫二鉀體系分相能力較弱，其中PEG 4 000～10 000與磷酸氫二鉀體系的相圖幾乎重合，說明PEG 4 000～10 000與磷酸氫二鉀體系的分相能力相同。

由圖2可知，磷酸氫二鉀與乙醇、異丙醇的分相能力較好，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍4%～34%，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍6%～48%都可以形成穩(wěn)定的雙水相；在異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍2.4%～30%，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍7%～48%都可以形成穩(wěn)定的雙水相。

圖2 醇-磷酸氫二鉀體系相圖Fig. 2 Phase diagrams of alcohol/K2HPO4 ATPS

圖3 異丙醇-鹽雙水相體系相圖Fig. 3 Phase diagrams of isopropanol/salt ATPS

由圖3可知，異丙醇與磷酸氫二鉀、硫酸銨、碳酸鈉均可在較大質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)形成雙水相。

2.1.2 2 種雙水相體系對鱖魚肌動(dòng)蛋白分離的影響

2.1.2.1 PEG-磷酸氫二鉀體系分離肌原纖維蛋白中的肌動(dòng)蛋白電泳

按照1.3.3節(jié)中的方法配制不同分子質(zhì)量的PEG與磷酸氫二鉀雙水相體系，如表2所示。加入肌原纖維蛋白后室溫靜置3 h，分離出上下相進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4所示。

表2 PEG-磷酸氫二鉀體系組成Table 2 Composition of PEG/K2HPO4 systems

圖4 PEG-磷酸氫二鉀體系提取肌動(dòng)蛋白SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE profile of actin extracted by PEG/K2HPO4 ATPS

由圖4可知，PEG 600-磷酸氫二鉀體系的上相有2 條帶：肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白；PEG 2 000～10 000與磷酸氫二鉀體系的上相有2 條帶：肌鈣蛋白和原肌球蛋白。所有體系的下相均沒有條帶檢出，所有體系均不能分離出肌動(dòng)蛋白單條帶。因此PEG-磷酸氫二鉀體系不能滿足本實(shí)驗(yàn)分離肌動(dòng)蛋白的要求，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不再采用PEG-磷酸氫二鉀體系。

2.1.2.2 醇-磷酸氫二鉀體系分離肌原纖維蛋白中的肌動(dòng)蛋白有機(jī)溶劑的選擇

按照1.3.3節(jié)中的方法配制不同短鏈醇與磷酸氫二鉀雙水相體系（表3），加入肌原纖維蛋白后室溫靜置3 h，分離出上下相進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖5所示。

圖5 醇-磷酸氫二鉀體系提取肌動(dòng)蛋白SDS-PAGE圖Fig. 5 SDS-PAGE profile of actin extracted by alcohol/K2HPO4 ATPS

表3 雙水相提取肌動(dòng)蛋白最佳有機(jī)溶劑的選擇Table 3 Choice of optimum organic solvent for ATPS

由圖5可知，正丙醇、異丙醇與磷酸氫二鉀體系的上相只有肌動(dòng)蛋白一條帶，下相沒有蛋白檢出。其他體系的上相或下相不只含有肌動(dòng)蛋白一條帶。由表3可以看出，異丙醇-磷酸氫二鉀體系提取肌動(dòng)蛋白的提取率最高，達(dá)11.74%。因此，最佳有機(jī)溶劑選擇異丙醇。

2.1.2.3 異丙醇-鹽體系分離肌原纖維蛋白中的肌動(dòng)蛋白無機(jī)鹽的選擇

按照1.3.3節(jié)中的方法配制不同無機(jī)鹽與異丙醇雙水相體系（表4），加入肌原纖維蛋白后室溫靜置3 h，分離出上下相進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖6所示。

圖6 異丙醇-鹽雙水相體系SDS-PAGE圖Fig. 6 SDS-PAGE profile of actin extracted by isopropanol/salt ATPS

表4 雙水相提取肌動(dòng)蛋白最佳無機(jī)鹽的選擇Table 4 Choice of optimum inorganic salt for ATPS

由圖6可知，異丙醇-碳酸鈉體系的上相含有肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，異丙醇-硫酸銨體系和異丙醇-磷酸氫二鉀體系的上相均只含有肌動(dòng)蛋白一種蛋白，不含肌球蛋白等其他蛋白。由表4可知，異丙醇-硫酸銨體系的肌動(dòng)蛋白提取率高于異丙醇-磷酸氫二鉀體系，因此最佳無機(jī)鹽選擇硫酸銨。

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化肌動(dòng)蛋白提取條件

2.2.1 異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肌動(dòng)蛋白提取率的影響

圖7 異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肌動(dòng)蛋白提取率的影響Fig. 7 Inf l uence of isopropanol concentration on actin extraction yield

雙水相體系硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，pH 7.0，加入肌原纖維蛋白溶液1 mL，考察不同異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肌動(dòng)蛋白提取率的影響。由圖7可知，當(dāng)體系中異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%時(shí)，肌動(dòng)蛋白提取率最高，達(dá)15.88%，隨著異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低或者增加，提取率都隨之降低。原因可能是由醇的親水/疏水平衡值變化引起的[28]。醇類物質(zhì)同時(shí)具有極性和非極性基團(tuán)，與蛋白質(zhì)分子的相互作用包含了親水相互作用和疏水相互作用的平衡；可能隨著醇用量的增加，上相中的親水/疏水平衡值改變，進(jìn)而影響肌動(dòng)蛋白提取率。因此，雙水相最佳異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%。

2.2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肌動(dòng)蛋白提取率的影響

圖8 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肌動(dòng)蛋白提取率的影響Fig. 8 Inf l uence of ammonium sulfate concentration on actin extraction yield

雙水相體系異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，pH 7.0，加入肌原纖維蛋白溶液1 mL，考察不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對肌動(dòng)蛋白提取率的影響。由圖8可知，隨著體系中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，提取率降低。當(dāng)體系中硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，肌動(dòng)蛋白提取率最高，達(dá)15.51%。可能是隨著鹽用量的增加導(dǎo)致下相體積增大、水增多，由于上相中水量減少致使上相的親水/疏水平衡值降低。因此，雙水相體系最佳硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

2.2.3 體系pH值對肌動(dòng)蛋白提取率的影響

圖9 體系pH值對肌動(dòng)蛋白提取率的影響Fig. 9 Inf l uence of pH on actin extraction yield

雙水相體系硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，加入肌原纖維蛋白溶液1 mL，考察體系不同pH值對肌動(dòng)蛋白提取率的影響。體系pH值變化可以改變蛋白質(zhì)表面的電荷，從而影響蛋白質(zhì)在兩相間的分布。由圖9可以看出，隨著pH值的增加，上相肌動(dòng)蛋白的提取率先升高后下降，且在體系的pH值為8時(shí)，肌動(dòng)蛋白提取率最高，為13.62%，隨著pH值的改變，提取率隨之降低，雙水相體系最佳pH值為8。

2.2.4 肌原纖維蛋白添加量對肌動(dòng)蛋白提取率的影響

圖10 不同肌原纖維蛋白加入量提取肌動(dòng)蛋白SDS-PAGE圖Fig. 10 SDS-PAGE profile of actin extracted with different amounts of myofibrillar proteins

雙水相體系硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，考察體系不同肌原纖維蛋白添加量對肌動(dòng)蛋白提取率的影響。由圖10可知，不同肌原纖維蛋白加入量的雙水相體系上相主要蛋白成分為肌動(dòng)蛋白。隨著肌原纖維蛋白加入量的增加，雜蛋白逐漸開始出現(xiàn)。當(dāng)加入量為20%時(shí)，開始出現(xiàn)雜蛋白d；當(dāng)加入量為30%時(shí)，開始出現(xiàn)雜蛋白a；當(dāng)加入量為40%時(shí)，開始出現(xiàn)雜蛋白b和c。研究表明，隨著肌原纖維蛋白加入量增加，對雙水相體系提取率有一定影響。

2.3 雙水相提取肌動(dòng)蛋白條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，選取硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和體系pH值3 個(gè)因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法對雙水相提取肌動(dòng)蛋白條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。以肌動(dòng)蛋白的提取率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化雙水相提取肌動(dòng)蛋白試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Box-Behnken design in terms of coded data with experimental values of actin extraction yield

表6 各因素和回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance of the effect of various factors on actin extraction yield

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到肌動(dòng)蛋白提取率與異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和體系pH值（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=10.48-1.10A-0.91B+1.66C-0.55AB+0.50AC-0.16BC-0.23A2-1.61B2+1.27C2。

由表6可知，回歸方程模型的P值為0.015 2，差異顯著，表明該方程擬合度較好。失擬項(xiàng)P值為0.356 9，差異不顯著，模型不失擬，選擇合理。各因素對肌動(dòng)蛋白提取率的影響順序?yàn)镃（體系pH值）＞A（異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞B（硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。當(dāng)優(yōu)化條件為異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%、pH 9.0時(shí)，模型預(yù)測肌動(dòng)蛋白提取率可達(dá)為13.815 2%。為了檢驗(yàn)預(yù)測模型的有效性，在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，肌動(dòng)蛋白提取率為11.04%，略低于回歸方程的預(yù)測值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39%。

提取的肌動(dòng)蛋白和兔肌動(dòng)蛋白采用SDS-PAGE法驗(yàn)證，結(jié)果如圖11所示，各泳道均出現(xiàn)清晰的肌動(dòng)蛋白條帶。雙水相上相溶液（泳道1）和兔肌動(dòng)蛋白溶液（泳道5）顯示出肌動(dòng)蛋白一條帶，無明顯雜蛋白；肌動(dòng)蛋白凍干粉溶液電泳圖中（泳道3、4）顯示有少量雜蛋白，推測在制備樣品凍干粉過程中，少量蛋白變性及少量高分子肌動(dòng)蛋白水不溶性。凍干粉水溶液經(jīng)分析型RP-HPLC檢測（圖12），與溶劑空白對照，面積積分顯示肌動(dòng)蛋白凍干粉的純度達(dá)到94.26%，表明雙水相體系分離肌動(dòng)蛋白的有效性。

圖11 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)SDS-PAGE圖Fig. 11 SDS-PAGE profile obtained in verification experiments

圖12 溶劑空白（a）及肌動(dòng)蛋白（b）HPLC圖Fig. 12 HPLC chromatograms of blank (a) and actin (b)

2.4 肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度分析與定量

2.4.1 雙水相組成體系放大與肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度分析

為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備樣品，在響應(yīng)面優(yōu)化雙水相體系組成體系的基礎(chǔ)上，用考馬斯亮藍(lán)法檢測雙水相體系上相肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖13所示，不同實(shí)驗(yàn)條件下雙水相體系上相的肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度有一定的差異。當(dāng)雙水相體系組成為異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%，pH 9.0時(shí)，肌動(dòng)蛋白測定質(zhì)量濃度最高，肌動(dòng)蛋白提取率達(dá)到13.54%，因此后續(xù)在此條件下進(jìn)行雙水相體系放大實(shí)驗(yàn)制備肌動(dòng)蛋白。

圖13 考馬斯亮藍(lán)法檢測肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度Fig. 13 Actin concentration determined by Coomassie blue method

2.4.2.2 肌動(dòng)蛋白樣品進(jìn)樣模式對肌動(dòng)蛋白出峰時(shí)間的影響

提取的鱖魚肌動(dòng)蛋白分別以凍干粉和透析液與內(nèi)標(biāo)物混合的形式進(jìn)樣，結(jié)果如圖16所示。透析液進(jìn)樣模式下的內(nèi)標(biāo)物和肌動(dòng)蛋白出峰時(shí)間分別為4.4 min和9.8 min；凍干粉進(jìn)樣模式下的內(nèi)標(biāo)物和肌動(dòng)蛋白出峰時(shí)間分別為4.5 min和9.7 min。2 種樣品進(jìn)樣模式下內(nèi)標(biāo)物和肌動(dòng)蛋白的出峰時(shí)間沒有差異，考慮到提取的鱖魚肌動(dòng)蛋白的保存，后續(xù)采用凍干粉進(jìn)樣模式對肌動(dòng)蛋白定量。

2.4.2 CE法定量分析肌動(dòng)蛋白

2.4.2.1 肌動(dòng)蛋白分離條件選擇與出峰時(shí)間確定

將兔肌動(dòng)蛋白、魚肌動(dòng)蛋白分別溶解后進(jìn)行CE法分析。由圖14可知，在磷酸鹽緩沖體系中，兔肌動(dòng)蛋白和提取的魚肌動(dòng)蛋白出峰時(shí)間均在12 min左右；由圖15可知，在四硼酸鈉-SDS緩沖體系中，兔肌動(dòng)蛋白和提取的魚肌動(dòng)蛋白的出峰時(shí)間均在10 min左右。肌動(dòng)蛋白在四硼酸鈉-SDS緩沖體系中的信號強(qiáng)度遠(yuǎn)高于磷酸鹽緩沖體系中的強(qiáng)度，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白易溶于四硼酸鈉-SDS溶液而難溶于磷酸鹽溶液，這是由于SDS具有吸附、增溶、形成膠束等功能[32]，可增加肌動(dòng)蛋白的溶解度、減少蛋白在毛細(xì)管壁的吸附程度，提高電泳的分離速度。因此選擇四硼酸鈉-SDS緩沖體系對肌動(dòng)蛋白定量檢測。

圖14 磷酸鹽體系肌動(dòng)蛋白的MECC-DAD圖Fig. 14 MECC-DAD chromatogram of actin separated in phosphate buffer solution

圖15 四硼酸鈉-SDS體系肌動(dòng)蛋白的MECC-DAD圖Fig. 15 MECC-DAD chromatogram of actin separated in sodium tetraborate-SDS system

圖16 鱖魚肌動(dòng)蛋白凍干粉（a）和透析液（b）進(jìn)樣的MECC-DAD圖Fig. 16 MECC-DAD chromatograms of fish actin lyophilized powder (a)and dialysate (b)

2.4.2.3 肌動(dòng)蛋白內(nèi)標(biāo)法定量分析

雙水相體系放大500 倍，肌原纖維蛋白加入量分別為10%和30%，制備肌動(dòng)蛋白凍干粉。研究中精確稱取凍干粉溶于緩沖液定容至5 mL，各取2 mL凍干粉復(fù)溶液，加入1 mL對乙酰氨基酚內(nèi)標(biāo)物（1 mg/mL），運(yùn)行緩沖液定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾后分別進(jìn)樣，記錄內(nèi)標(biāo)物和肌動(dòng)蛋白的峰面積，計(jì)算出肌動(dòng)蛋白含量。

圖17 內(nèi)標(biāo)物和凍干粉樣品檢測的MECC-DAD圖Fig. 17 MECC-DAD chromatograms of internal standard and lyophilized powder sample

表7 CE定量檢測肌動(dòng)蛋白含量Table 7 Quantitative detection of actin content by MECC-DAD

由圖17可知，內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間為4.5 min；2 個(gè)批次肌動(dòng)蛋白樣品MECC-DAD圖基線平穩(wěn)，無雜峰干擾。由表7可知，肌原纖維蛋白加入量為10%和30%制備的肌動(dòng)蛋白CE檢測含量相近，每個(gè)樣品3 次測定結(jié)果比較接近，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，重復(fù)性良好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)篩選了高分子PEG-鹽和低分子醇-鹽2 種雙水相體系提取鱖魚肌原纖維蛋白中的肌動(dòng)蛋白，結(jié)合SDS-PAGE和肌動(dòng)蛋白提取率最終確定最佳分離體系為異丙醇-硫酸銨雙水相體系。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法分析確定了雙水相提取鱖魚肌動(dòng)蛋白的最佳工藝條件：異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%、pH 9.0。在此工藝條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，肌動(dòng)蛋白提取率為（11.04±0.54）%，略低于模型預(yù)測值。毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜MECC-DAD法研究結(jié)果顯示，肌動(dòng)蛋白的定量出峰時(shí)間約為10 min，CE圖譜基線平穩(wěn)無雜峰。肌原纖維蛋白加入量分別為10%和30%，放大制備肌動(dòng)蛋白凍干粉，檢測含量相近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，重復(fù)性良好。研究結(jié)果為名貴魚類質(zhì)量品質(zhì)屬性鑒定及魚類肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的研制奠定基礎(chǔ)，為魚類蛋白功能開發(fā)利用及快速定量檢測提供理論依據(jù)。