不同季節保靖黃金茶1號工夫紅茶揮發性成分的HS-SPME-GC-MS 分析

黃 浩，余鵬輝,2,3，趙 熙，鐘 妮,2,3，鄭紅發,*

（1.湖南省農業科學院茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農業大學 教育部茶學重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

黃金茶原產于湖南湘西地區保靖縣葫蘆鎮黃金村，是經長期自然選擇而形成的一種富含氨基酸的特異茶樹品種資源[1]，具有萌芽早、品質優、產量高、抗性強等特點，因“一兩黃金一兩茶”而得名[2]，現已從中選育出保靖黃金茶1號、2號、168號等特色茶樹新品種3 個[3-5]。黃金茶內質豐富，所制綠茶品質突出，具有“四高四絕”的品質特征[2]，享有“中國最好的綠茶之一”的美譽。同時，黃金茶還具有較強紅茶適制性，所制紅茶烏黑油潤顯金毫，滋味醇和甘爽，香氣高長[6]。受飲茶習慣和經濟效益的影響，每年春季的3-5月，黃金茶多被加工成名優綠茶，之后才被加工成紅茶和其他茶類，因此與該品種的綠茶相比，保靖黃金茶1號加工的工夫紅茶產品風格不一，品質不高，外界對其認知不足。

香氣是茶葉品質的重要因素之一，其實質是不同芳香物質以不同濃度組合，并對嗅覺神經綜合作用所形成的茶葉特有的香型[7]，茶葉香氣受茶樹品種、栽培措施、加工時間、加工工藝和貯藏條件等綜合影響，可作為判別茶葉品質優劣的關鍵因子[8]。就季節而言，可分為春茶、夏茶和秋茶，季節不同，茶樹生長受氣候、濕度、水分、溫度等生態環境的影響，其酶的特性、化學成分與化學特性存在不同程度的差異，制茶香氣品質不盡相同[9]。王華夫等[10]研究表明，各季節祁紅地區主要茶樹品種茶鮮葉中，鍵合態和游離態香氣成分含量表現為春季高于夏季和秋季，即春茶香氣最高，秋茶次之，夏茶香氣最低；張正竹等[11]研究表明，櫧葉齊鮮葉中春、秋季的糖苷類香氣前體總量高于夏季，且香氣前體種類則隨季節變化的消長規律也存在明顯差異；而烏龍茶加工研究表明，秋季鮮葉制茶香氣高銳，品質最優，春季鮮葉制茶香氣較高，品質次之，夏季鮮葉制茶香氣較低，品質最差[12]。由此可知，生產季節對茶葉香氣品質的形成具有重要的作用。香氣化合物的提取方法——頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME）法具有精準靈敏、簡便快速的特點[13-15]，已被廣泛應用于酒類[16-18]、水果[19]、鮮花[20]、辣椒[21]、青稞[22]和茶葉[23-25]等材料的香氣分析，能較好地反映樣品中的揮發性香氣組分。因此，本研究選用保靖黃金茶1號這一特異湖南主栽茶樹品種加工的工夫紅茶樣品為研究對象，采用HS-SPME結合氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析其一年生長發育周期內不同季節的揮發性香氣組分，結合樣品的感官審評與香氣指數分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）和分層聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等多元統計分析，明確保靖黃金茶1號各季節紅茶特異性香氣成分、不同季節標志差異性成分并探討其香氣發展趨勢，以進一步豐富湖南工夫紅茶香氣品質化學理論，為湖南工夫紅茶香氣品質形成機理及加工過程品質調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別于2018年4月、2018年7月和2018年9月，在湖南省茶葉研究所實驗茶場（位于長沙縣高橋鎮）生產茶園，手工采摘一芽一葉的保靖黃金茶1號鮮葉，按照湖南工夫紅茶的標準化工藝分別加工成工夫紅茶，單個季節每1 周制樣1 次，所得工夫紅茶樣品9 個，分別編號為A4-1、A4-2、A4-3，B7-1、B7-2、B7-3，C9-1、C9-2、C9-3。

癸酸乙酯標準品（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司；NaCl（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；超純水由Millipore超純水儀制得。

1.2 儀器與設備

手動SPME進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；SPME專用加熱磁力攪拌裝置美國Corning公司；明澈-D 24UV超純水系統 美國Millipore公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AE240萬分之一電子天平 美國梅特勒-托利多公司；DW-86L338立式超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；15 mL透明樣品瓶 德國CNW公司；BJ-150型高速多功能粉碎機 浙江德清拜杰電器有限公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 工夫紅茶加工流程

參照湖南工夫紅茶加工技術規程[26]：手工采摘一芽一葉保靖黃金茶1號鮮葉3.5 kg，在人工氣候箱內進行萎凋，至鮮葉含水率達60%～62%，采用25型揉捻機進行揉捻：空揉（15 min）→輕壓揉捻（15 min）→中壓揉捻（15 min）→重壓揉捻（20 min）→松壓揉捻（5 min）→下機解塊；發酵室溫度30 ℃，相對濕度95%，發酵時長4 h；干燥用提香機初烘溫度120 ℃，時間15 min，適當攤涼后進行足干，足干溫度90 ℃，時間60 min。

1.3.2 感官審評

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》和GB/T 14487—2017《茶葉感官審評術語》，組織3 位具有長期茶葉審評經驗的茶葉專家對供試樣茶進行感官審評。

1.3.3 HS-SPME分析

準確稱取5 g粉碎茶葉樣品放入100 mL頂空瓶中，加入50 mL沸水，加入一定量內標（癸酸乙酯），然后將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDM萃取頭的SPME手持器通過瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶頂空部分，在60 ℃水浴中平衡10 min后推出纖維頭，吸附50 min，待萃取完成后收回纖維頭立即插入GC進樣口，解吸附3 min。

1.3.4 GC-MS分析

G C條件：D B-5 M S彈性石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；手動脈沖不分流進樣；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z50～550；四極桿溫度150 ℃。1.3.5 工夫紅茶香氣組分定性與定量分析

利用NIST標準譜庫對GC-MS分析得到的色譜峰信息進行串聯檢索和人工解析，結合文獻報道及待測物質的相對保留時間進行鑒定；釆用內標法定量，將最終確定的香氣組分按照面積歸一法計算獲得各組分的相對含量。

1.4 數據處理

實驗重復3 次，取平均值并計算相對偏差；Excle 2010（Microsoft，美國）、IBM SPSS Statistics 24（IBM, 美國）、Simca-P 14.0（Umetrics AB, 瑞典）、Origin 2017（OriginLab，美國）及Adobe Illustrator CS6（Adobe，美國）等軟件用于本實驗所有數據統計分析及相關圖片的制作與處理。

2 結果與分析

2.1 不同季節工夫紅茶感官審評

表1 不同季節保靖黃金茶1號工夫紅茶香氣感官審評結果Table 1 Sensory analysis of aroma attributes of Congou black tea samples from different harvesting seasons

由表1可知，春季、夏季和秋季工夫紅茶香氣均以甜香為主要特征，其中春季紅茶表現為甜香純正，夏季紅茶表現為甜香尚高，秋季紅茶則表現為甜香帶花香，香氣品質描述以秋季最好，其次是夏季和春季，表明在品種原料級別與加工工藝一致的前提下，季節的差異導致工夫紅茶品質風格差別較大。而同一季節內不同工夫紅茶樣品感官品質表現較為一致，表明本研究中加工工藝對保持工夫紅茶品質的穩定性與準確性無干擾影響。

2.2 不同季節工夫紅茶揮發性成分的組成特點

2.2.1 不同季節工夫紅茶揮發性成分的組成與含量

圖1 三季工夫紅茶揮發性組分的GC-MS代表性總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of volatile components of Congou black tea samples from different harvesting seasons

對3 個季節工夫紅茶樣品的香氣成分進行GC-MS檢測分析，如圖1所示。其種類及相對含量如表2和圖2、3所示。由表2可知，3 個季節工夫紅茶樣品檢出并鑒定到80 種揮發性成分，春、夏和秋季紅茶樣品中分別檢測出51、63 種和66 種揮發性香氣成分，包括醛類27 種、碳氫化合物16 種、酮類13 種、醇類12 種、酯類7 種、雜氧化合物1 種、酚類1 種、含氮化合物1 種、含硫化合物1 種和其他1 種。揮發性成分的種類與含量隨著春季、夏季、秋季的推移逐漸增加，其秋季紅茶中揮發性成分種類與含量均為最多，共66 種，總量為345.67 μg/L，其次為夏季紅茶，共63 種，總量為271.61 μg/L，春季紅茶中最少，共51 種，總量為206.09 μg/L。

表2 不同季節保靖黃金茶1號工夫紅茶香氣化合物的組成和含量Table 2 Analysis of volatile organic compounds in Congou black tea samples from different harvesting seasons

續表2

續表2

三季工夫紅茶香氣物質主要以醛類、醇類、酯類和碳氫化合物為主，其中醛類物質種類最多，香氣含量較高，在春、夏和秋季紅茶中分別檢測鑒定到17、26 種和24 種，相對含量分別為28.32%、43.23%和27.54%；其次是醇類物質，在春、夏和秋季茶樣中分別檢測鑒定到8、9 種和12 種，相對含量分別為27.385%、25.59%和29.89%；再是酯類物質，在春、夏和秋季茶樣中分別檢測鑒定到4、3 種和6 種，相對含量分別為17.49%、10.64%和25.43%；碳氫化合物，在春、夏和秋季茶樣中分別檢測鑒定到11、12 種和13 種，相對含量分別為17.20%、8.39%和9.97%。

圖2 不同季節工夫紅茶揮發性香氣組分含量及占比Fig. 2 Relative contents of volatile components in Congou black tea samples from different harvesting seasons

圖3 三季紅茶中共有香氣組分散點圖Fig. 3 Scatter plot for aroma components common to Congou black tea samples from different harvesting seasons

三季工夫紅茶中共有香氣成分有40 種，分別占春季、夏季和秋季工夫紅茶檢測香氣總量的87.7%、86.5%和85.2%，主要以醇類、醛類、碳氫化合物、酯類和酮類物質為主，將40 種共有香氣繪制散點圖（圖3），直觀地了解三季紅茶中香氣成分所占相對含量及相同香氣成分在不同季節茶的相對含量。如在秋茶中水楊酸甲酯相對含量最多，其次是芳樟醇；同一物質芳樟醇在秋茶的相對含量最多，其次是春茶、夏茶。

2.2.2 不同季節工夫紅茶香氣指數分析

表3 3 個季節工夫紅茶的香氣指數Table 3 FI of Congou black tea samples from different harvesting seasons

Owuor香氣指數能反映茶葉的香氣品質，香氣指數高的紅茶，其香氣品質較好[27]。Owuor分析了世界主產茶國紅茶的香氣組成，將主要香氣成分分為兩組，第1組包括己醛、戊烯-2-醇、順-3-己烯醛、反-2-己烯醛、順-2-戊烯醇、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、戊醇、己醇及2,4-庚二烯醛等化合物，這些化合物對紅茶的特征香氣很重要，但濃度過高會產生不良香氣（如青草氣）；第2組包括苯甲醛、芳樟醇及其氧化物、苯乙醛、水楊酸甲酯、香葉醇、香葉酸、苯甲醇及β-紫羅酮等化合物，它們能使紅茶產生甜潤花香。第2組化合物總量與第1組化合物總量之比即為Owuor香氣指數。不同季節工夫紅茶中，秋茶的香氣品質最好，香氣甜香帶花果香；其次是夏茶，甜香尚高；春茶的香氣是甜香尚純。以上結果表明，香氣指數與三季工夫紅茶的審評結果相符合。

2.3 不同季節工夫紅茶揮發性成分差異分析

2.3.1 不同季節工夫紅茶揮發性成分的主要成分及特有成分分析

圖4 三季紅茶中特異香氣成分的相對含量Fig. 4 Relative contents of aroma components unique to Congou black tea samples from each harvesting season

春茶相對含量較高的香氣成分為芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、苯乙醛、苯甲醛、月桂烯、反-2-己烯醛、苯乙烯、1-乙基-2-甲酰吡咯、β-紫羅酮和壬醛，平均含量分別占香氣總量的23.83%、15.96%、6.25%、4.90%、4.88%、3.85%、3.32%、2.25%、2.15%、2.11%；夏茶相對含量較高的香氣成分為芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、β-紫羅酮、反-2-己烯醛、藏紅花醛、2-辛烯-1-醛和β-環檸檬醛，平均含量分別占香氣總量的20.84%、9.61%、9.09%、7.24%、2.87%、2.69%、2.15%、2.13%、1.85%、1.83%；秋茶相對含量較高的香氣成分為水楊酸甲酯、芳樟醇及其氧化物、苯甲醛、苯乙醛、藏紅花醛、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇、月桂烯、反-橙花叔醇、反-2-己烯醛、壬醛，平均含量分別占香氣總量的23.57%、22.04%、4.17%、3.96%、2.70%、2.63%、2.45%、2.34%、2.25%、2.09%。各揮發性組分類別在3 個季節的占比結果顯示，醇類和酯類在秋季紅茶中占比高于春季和夏季，醛類和酮類在夏季紅茶中占比高于春季和秋季，而碳氫化合物則在春季紅茶中占比高于夏季和秋季（圖2B）。

由圖4可知，三季紅茶中特異香氣成分種類與含量隨季節變化而逐漸增加，其特異香氣成分種類分別占春季、夏季和秋季工夫紅茶檢測香氣總量的1.1%（3 種）、2.9%（8 種）和4.0%（9 種）。其中春季紅茶特有成分為2-甲基萘、反-2-(2-戊烯基)呋喃、2,6-二叔丁基苯醌；夏季紅茶特有成分為戊醛、反,反-2,4-己二烯醛、1-戊烯-3-酮、6-甲基-2-庚酮、3,5-辛二烯-2-酮、6,10-二甲基-十一烷-2-酮、γ-十一烷酸內酯、甲苯；秋季紅茶特有成分為順-2-戊烯醇、苯乙醇、糠醛、1-辛烯-3-酮、順-茉莉酮、順-3-己烯異戊酸酯、己酸己酯、反-石竹烯、α-法呢烯。

2.3.2 不同季節工夫紅茶香氣成分的判別分析

圖5 不同季節工夫紅茶揮發性成分PCA（A）與HCA（B）Fig. 5 PCA (A) and HCA (B) of volatile components of Congou black tea samples from different harvesting seasons

本研究以所有工夫紅茶揮發性組分相對含量建立PCA模型，結果顯示3 個主成分共提取到揮發性成分94.1%的信息，其中擬合參數為R2X＝0.941、Q2＝0.825。同時采用HCA對PCA所得全部3 個主成分進行歸類（圖5），根據HCA圖可知，聚類分析將三季節茶分為2 類，夏季和秋季工夫紅茶聚為1 類，春季紅茶單獨成1 類，說明同1 種茶樹鮮葉在加工工藝相同時，春季紅茶與夏、秋季紅茶的香氣特征差距較大，此分類結果與三季工夫紅茶感官評價結果基本保持一致，同時說明季節這個指定變量也可作為影響保靖黃金茶工夫紅茶香氣特色的一個重要指標。

圖6 不同季節工夫紅茶揮發性成分PLS-DA得分圖與驗證模型Fig. 6 Score plot and cross-validation of PLS-DA model for volatile components of Congou black tea samples from different harvesting seasons

為比較保靖黃金茶工夫紅茶揮發性成分在不同季節的變化與差異，對所有樣品的揮發性成分進行多元統計分析，基于各樣品香氣成分的檢測結果建立PLS-DA模型（采用SIMCA-P 14.0軟件），通過該模型可有效地區分春、夏和秋三季的工夫紅茶樣品（圖6a），擬合參數為R2X＝0.972、R2Y＝0.994、Q2＝0.982，同時使用置換檢驗方法考察PLS-DA模型的建模效果，結果顯示經過200次交叉驗證后，模型的截距明顯低于原始模型，圖6b表明，模型沒有過度擬合現象，所建模型較為可靠（R2＝0.351、Q2＝－0.358）。對于潛在的差異揮發性成分，使用變量投影重要性因子（variable important in projection，VIP）值大于1的進行不同季節差異揮發性成分篩選。由圖7可知，VIP值大于1的化合物有20 種，為了使分析結果更為準確，采用Kruskal-Wallis檢驗[28]對VIP值大于1的化合物進行進一步分析。如表4所示，20 種VIP值大于1的化合物中，大部分化合物的P值小于0.05，即在3 個季節樣品中存在統計學差異，被鑒定為不同季節工夫紅茶間的標志差異性揮發性成分，分別為水楊酸甲酯、苯甲醛、月桂烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇、1-乙基-2-甲酰吡咯、藏紅花醛、反-橙花叔醇、苯乙烯、2-辛烯-1-醛、反-2-癸烯醛、苯乙醇、反-芳樟醇氧化物（吡喃型）、反-2-壬烯醛。如表4所示，13 種揮發性成分的香氣特征描述不盡相同，主要表現為冬青油香、花果香、甜香、木香及肉香等，推測這些化合物在不同季節工夫紅茶中含量分布的差異對相應工夫紅茶的香氣品質形成有著重要的影響。

圖7 三季工夫紅茶揮發性成分的VIP值Fig. 7 VIP values of volatile components of Congou black tea samples from different harvesting seasons

表4 PLS-DA模型中VIP值大于1的20 種揮發性化合物P值及其香氣特征描述與香氣強度值Table 4 Twenty volatile components with VIP ＞ 1 from PLS-DA model and their P values, aroma OAV values and characteristics

注：香氣強度值=茶樣品中的濃度/嗅覺閾值，閾值由查閱相關文獻得到；—.未查詢到。

2.3.3 不同季節工夫紅茶標志差異性成分的HCA及香氣變化趨勢

圖8 三季工夫紅茶13 種標志差異性揮發性成分的譜系和Heatmap分析Fig. 8 Heatmap and feature-wise HCA dendrogram of 13 VOCs that significantly differed among Congou black tea samples from different harvesting seasons

為進一步分析季節對保靖黃金茶1號工夫紅茶香氣品質的影響，在2.3.2節基礎上對13 種標志差異性化合物做譜系和熱圖分析，以便更好地體現這13 種差異化合物在各季節工夫紅茶樣品中的分析及變化趨勢。由圖8可知，根據這些化合物及其含量在各樣品中的分布基本可以分為3 類：I類，共有5 種揮發性成分，這些化合物分屬醇類、酯類和醛類化合物，且香氣特征普遍偏冬青油香、花香和藥香，除苯乙醇為秋季紅茶樣品的特異性化合物外，其余4 種成分在樣品中的分布總體隨春→夏→秋季的變化而逐漸增加；II類，共有5 種揮發性成分，該類化合物在夏、秋季紅茶樣品中的分布基本均高于春季樣品，這些化合物分屬醇類和醛類化合物，香氣特征普遍偏花果香、杏仁香和肉香，其中反-芳樟醇氧化物（吡喃型）、反-2-壬烯醛和反-2-癸烯醛只存在夏、秋季紅茶樣品中；III類，共有3 種揮發性成分，這些化合物均為碳氫化合物，其中1-乙基-2-甲酰吡咯和月桂烯只存在春、秋兩季紅茶樣品中。

3 結論與討論

保靖黃金茶1號一種富含氨基酸的特異茶樹資源，具有紅、綠茶兼制的特性，制綠茶品質突出，辨識度高。與綠茶相比，該品種加工的工夫紅茶產品風格不一，品質有待提升。為發掘保靖黃金茶工夫紅茶各季節的香氣品質特點，全面提升保靖黃金茶1號工夫紅茶的產品質量，本研究對保靖黃金茶1號一年生長發育周期內不同季節的香氣進行了分析。就感官審評而言，春、夏和秋季工夫紅茶香氣均以甜香為主要特征，其中秋季紅茶香氣品質最好，香氣甜香帶花香，其次是夏季紅茶，香氣甜香尚高，再是春季紅茶，香氣甜香純正。由此可見，不同季節下黃金茶加工的工夫紅茶品質風格迥異，其中秋季的鮮葉更易加工成大眾追捧的花果香、蜜香風格的工夫紅茶[29]。

3 個季節工夫紅茶樣品檢出并鑒定到80 種揮發性成分，三季紅茶樣品的香氣組成以醛類、醇類、酯類和碳氫化合物為主，其中醇類和酯類在秋季紅茶中占比最高，醛類和酮類在夏季紅茶中占比最高，而碳氫化合物則在春季紅茶中占比最高。賴幸菲等[30]以香氣為主要特點的烏龍茶品種金萱為原料加工工夫紅茶，結果表明，秋茶的香氣品質最好，夏茶次之，春茶最次。香氣指數表明，本研究結果與賴幸菲等[30]的研究結果一致。由此可見，工夫紅茶特征香氣不僅取決于香氣成分的種類和含量，還和香氣活度值及其相互間協同作用密切相關[31]，因此后續研究有必要采用GC嗅覺測量法聯合香氣活度值對工夫紅茶活性成分進一步進行分析鑒定，為全面提高工夫紅茶品質提供理論基礎。基于揮發性化合物相對含量的PLS-DA模型將3 個不同季節的工夫紅茶有效地區分，并鑒定出VIP值大于1且具有統計學差異的標志差異性香氣成分13 種。進一步的HCA結果表明，I類化合物（水楊酸甲酯、苯乙醇等）是隨著季節的變化而逐漸增加，II類化合物主要為醇類、醛類，其含量表現為夏季＞秋季＞春季，III類化合物主要為碳氫化合物，其含量則是春、秋季＞夏季。以上3 類化合物的組成與含量分布基本能反應保靖黃金茶1號工夫紅茶的香氣變化趨勢，對判定保靖黃金茶1號工夫紅茶香氣組成具有一定的作用。在本研究基礎上，將擴大樣本量研究不同產地保靖黃金茶1號工夫紅茶及其加工過程中香氣品質的變化，以期為深入了解保靖黃金茶1號工夫紅茶香氣品質形成機理及全面提高該品種工夫紅茶產品質量提供依據。