本土畢赤克魯維酵母與釀酒酵母混合發酵葡萄酒的增香潛力分析

張文靜，楊詩妮，杜 爽，姜 嬌，葉冬青*，劉延琳*

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

葡萄酒釀造主要是酵母菌將糖轉化為乙醇的復雜過程。發酵過程中，酵母菌種類呈規律變化，非釀酒酵母和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）之間的相互作用不僅影響發酵進程，而且對葡萄酒的色澤、香氣、感官質量及產品風格的形成都起到至關重要的作用[1]。葡萄酒工業發酵傾向于使用S. cerevisiae以保證葡萄酒發酵順利進行，但在一定程度上也降低了葡萄酒的風味多樣性。近年來隨著對非釀酒酵母微生物特征和釀造特性的深入研究，其對葡萄酒風味的積極影響廣受關注[2-4]。畢赤酵母屬酵母具有高產乙酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等酯類物質的特性，在提高葡萄酒花香及果香特征方面具有極大的應用潛力[2]。畢赤克魯維酵母（Pichia kluyveri）作為其中最受關注的菌種之一，已有國外公司推出了商業化的純種發酵劑[5]，其在各類發酵產品中的應用不斷被報道。比如，Amaya-Delgado等[6]將P. kluyveri用于龍舌蘭釀造發現其具有優良的乙醇耐受性和產乙醇能力，且可促進乳酸乙酯的生成；Batista等[7]研究發現P. kluyveri有利于可可發酵過程中咖啡風味的形成；Wei Jianping等[8]將P. kluyveri用于蘋果酒發酵，發現其能賦予蘋果酒熱帶水果風味。

與S. cerevisiae相比，由于非釀酒酵母在葡萄醪生境中生長緩慢、乙醇轉化力較弱，利用非釀酒酵母純種發酵可能會導致葡萄酒發酵延滯，因此通常采用混合接種策略，既確保了發酵的順利進行，又保留了非釀酒酵母的發酵特征，對葡萄酒香氣質量的提升有重要意義[3]。Prior等[9]研究發現利用P. kluyveri和S. cerevisiae混合接種發酵可顯著提高葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量；Lu Yuyun等[10]研究發現P. kluyveri和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）混合接種發酵可顯著提高榴蓮酒中乙酸乙酯和乙酸異戊酯等物質含量；此外，在混合接種策略中，接種比例對葡萄酒質量及香氣有顯著影響。楊詩妮等[11]利用戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和S. cerevisiae順序接種混合發酵，發現接種比例為20∶1時，葡萄酒中揮發酸含量顯著降低；王倩倩等[12]發現在同時接種混合發酵中，高比例接種發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）會顯著降低S. cerevisiae最大生長數量，且給葡萄酒帶來較強的生青味。Anfang等[13]研究發現P. kluyveri與S. cerevisiae以1∶9接種比例混合發酵可顯著增加葡萄酒中果香硫醇的含量。因此，對接種比例進行優化是混合釀造工藝中的關鍵點。

利用具有優良釀酒特性的本土酵母有助于塑造葡萄酒的產區或地域典型性，非釀酒酵母與S. cerevisiae混合發酵作為當下的研究熱點，是避免產品同質化、獲得高品質葡萄酒的有效釀造方法[14]。我國葡萄酒產區氣候變化多樣，酵母資源極其豐富，而相關的研究尚處于起步階段。P. kluyveri廣泛存在于葡萄酒自然發酵前期，能夠促進葡萄酒中酯類物質的生成，具有廣闊的應用前景[2]。但目前關于P. kluyveri對葡萄酒香氣影響的研究還不夠充分，尚鮮見有關中國本土P. kluyveri與S. cerevisiae混合接種增香釀造的報道。本研究以課題組前期優選的本土P. kluyveri HS-2-1[15]和S. cerevisiae NX11424[16]為材料，按照小容器釀造工藝法[17]探究不同接種比例的P. kluyveri對葡萄酒香氣的影響。進一步研究優選P. kluyveri的釀造學特性，獲得P. kluyveri與S. cerevisiae混合發酵釀造赤霞珠干紅葡萄酒的最佳接種比例，旨在為改善國內葡萄酒單一風味、提高香氣質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠，2016年購自陜西咸陽瑞那酒莊，初始糖度280 g/L，pH 3.85，總酸4.8 g/L。

P. kluyveri HS-2-1分離自賀蘭山東麓產區自然發酵葡萄醪；S. cerevisiae NX11424分離自寧夏產區自然發酵葡萄醪，保藏于西北農林科技大學葡萄酒學院。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract protein dextrose，YEPD）培養基、WLN（Wallerstein laboratory nutrient）培養基配制參考文獻[18]，所用試劑均為國產分析純。

乙酸乙酯、癸酸乙酯、異丁醇、苯乙醇和辛酸等標準品（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BK1301生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭、固相微萃取裝置 美國Supelco公司；6890-5975氣相色譜-質譜聯用儀、HP-Innowax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 小容器發酵

在2 L發酵罐中加入約1.5 L葡萄醪，隨后添加60 mg/L SO2和600 mg/L二甲基二碳酸鹽[19]過夜滅菌處理。處理好的葡萄醪先接入HS-2-1，發酵48 h后以1∶1、10∶1和20∶1的接種比例接種NX11424，其中HS-2-1接種量約為1×106CFU/mL（血球板計數法），NX11424的接種量按比例計算；以S1、S10、S20表示HS-2-1和NX11424混合接種比例依次為1∶1、10∶1、20∶1。以HS-2-1純種發酵（PK組）和NX11424純種發酵（SC組）為對照，發酵溫度為25 ℃，每個處理設置3 組重復。

1.3.2 菌落數檢測

采用稀釋平板計數法。WLN培養基中添加20 μg/mL氯霉素，排除雜菌生長對酵母菌總菌數檢測的干擾。在葡萄酒發酵4 個關鍵點取樣涂布（發酵啟動ST1：糖開始下降；旺盛期ST2：二次接種；發酵后期ST3：糖消耗約3/4；發酵結束ST4：糖質量濃度低于4.0 g/L）。根據S. cerevisiae和非釀酒酵母在WLN平板上菌落形態進行分類統計，其中S. cerevisiae菌落有光澤、乳白色球狀凸起、邊緣規則；P. kluyveri菌落呈奶油色至灰綠色，表面干燥，中間平坦，邊緣呈放射狀[20]。

1.3.3 理化指標檢測

發酵過程中每24 h取樣測定還原糖含量，待還原糖質量濃度不大于4 g/L且不再降低時加入50 mg/L SO2終止發酵[17]。發酵結束后參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定葡萄酒基本理化指標。

1.3.4 香氣成分測定

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術，具體方法參考蔡建等[21]。取5.0 mL葡萄酒加入到15 mL樣品瓶中，同時加入1.0 g NaCl和10 μL的4-甲基-2-戊醇（內標，2.004 g/L）后密封樣品瓶，在40 ℃、180 r/min條件平衡30 min，然后插入萃取頭萃取30 min后進樣，解析8 min。升溫程序為：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min的速率升到220 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，平均線速率為25 cm/s。采用不分流進樣模式，所有質譜在電子能量70 eV條件下沖擊，質量掃描范圍m/z 29～350。

質譜結果利用計算機譜庫（NIST14）并結合文獻進行各揮發性物質的定性。對于已有標準品的物質，采用外標法定量；沒有標準品的物質利用化學結構相似、碳原子數相近的標準品物質的標準曲線進行相對定量[21]。

1.3.5 香氣活性值計算及氣味特征分類

香氣活性值（odour activity value，OAV）由物質含量除以其嗅覺閾值得到，本研究中香氣物質的嗅覺閾值及香氣描述均引自文獻[21-24]。

根據文獻[21,25]，將葡萄酒中香氣物質按照其氣味特征可分為9組：1=果香，2=花香，3=植物味，4=堅果香，5=焦糖味，6=土腥味，7=化學味，8=脂肪味，9=烘烤味，對所有OAV大于0.1的香氣物質進行分組，各組物質OAV的總和表示葡萄酒該類香氣輪廓特征。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計；SPSS 16.0進行數據分析，多組間比較采用One-Way ANOVA法，不同處理供試酒樣中香氣成分分布規律采用主成分分析（principal component analysis，PCA）；使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵曲線

圖1 不同發酵處理發酵曲線Fig. 1 Fermentation curves with different starter cultures

如圖1所示，所有發酵組均能完成發酵。SC組最快，歷時7 d，PK組耗時最長，約11 d完成，不同接種比例混合發酵組（S1、S10、S20）均10 d左右完成發酵。發酵前2 d各處理發酵速率與SC組保持一致。但隨著發酵進行，發酵速率呈現明顯差異，SC＞PK＞混合接種發酵處理（S1、S10、S20）。與SC組相比，P. kluyveri的接入在一定程度上延緩了發酵進程，這是非釀酒酵母發酵能力相對較弱的體現[2]。

2.2 發酵過程中活菌數變化

圖2 不同接種處理發酵中P. kluyver與S. cerevisiae菌株在不同階段的數量變化Fig. 2 Populations of P. kluyver and S. cerevisiae at different stages of fermentation

圖2 為在不同發酵處理中4 個關鍵時期S. cerevisiae和P. kluyveri的菌落數變化。整體看，S. cerevisiae和P. kluyveri的菌落數在發酵過程中均呈現先上升后下降的趨勢。由于接種比例的不同，混合發酵處理酒樣中NX11424的生長受到不同程度的抑制。與SC組相比，混合發酵處理酒樣中NX11424的最大增殖量和發酵結束后菌落數均降低，不同接種比例處理之間發酵結束后S. cerevisiae的菌落數無明顯差別，這與Fleet等[1]的研究結果一致。發酵過程中酵母菌之間存在競爭作用，隨著發酵的進行，生長能力及耐受性更強的S. cerevisiae迅速占據主導地位，處于弱勢地位的P. kluyveri菌落數下降較快。本實驗中HS-2-1菌落數在ST2開始劇烈下降。此外，混合發酵處理中HS-2-1的最大增殖量和發酵結束后菌落數均顯著高于PK組，且S10組的最大增殖量最高（1.30×108CFU/mL），這可能與不同種屬酵母之間存在生長協同作用有關[26]，二者的互作關系有待進一步研究。實驗結果表明，HS-2-1在葡萄酒釀造過程中具有良好的定植能力，在整個發酵過程中均能保持一定的生物量水平。混合接種不會影響乙醇發酵的正常進行，且在一定程度上能減緩HS-2-1的衰亡。

2.3 理化指標分析

表1 發酵結束后酒樣的基本理化指標Table 1 Chemical composition of wines at the end of fermentation

如表1所示，所有處理都完成了乙醇發酵，殘糖質量濃度均低于4 g/L，乙醇體積分數約為13%。相較于SC組，其他處理酒樣中總酸含量升高，揮發酸含量降低，其中PK組酒樣總酸質量濃度最高（6.44 g/L），S1組酒樣揮發酸質量濃度最低（0.25 g/L）。這可能由于菌株HS-2-1具有嗜殺特性[15]，研究表明嗜殺酵母能夠有效抑制發酵過程中腐敗微生物的生長，凈化發酵體系，從而降低揮發酸含量[27]。

2.4 香氣成分分析

對發酵后葡萄酒樣進行香氣分析，共檢測到46 種物質，包括16 種高級醇類物質、19 種酯類物質、6 種脂肪酸類物質以及5 種其他物質（表2）。各處理間香氣物質組成種類沒有顯著差異，但物質含量存在顯著差異。

高級醇是葡萄酒中重要的香氣物質，總質量濃度超過400 mg/L時，會帶來強烈的刺鼻味，而低于300 mg/L時，可以增加香氣復雜性[28]。各處理酒樣中高級醇質量濃度均低于300 mg/L。與SC組相比，混合發酵處理（S10、S20）酒樣中高級醇總量顯著升高，其中S20組酒樣中高級醇總量最高（176.92 mg/L），提高了24.19%。這與王倩倩等[12]在P. fermentans中的研究結果相似，混合發酵處理中高比例接種P. fermentans提高了葡萄酒中高級醇類物質含量，而這與非釀酒酵母的存活數量及存活時間密切相關[29]。2-苯乙醇可為葡萄酒帶來玫瑰香等愉悅香氣[30]，本研究發現高比例接種P. kluyvei的酒樣中2-苯乙醇含量顯著提高，其中PK組酒樣中2-苯乙醇質量濃度最高（8.27 mg/L）。一般認為非釀酒酵母具有更高的苯乙醇產生能力[3]，如Andorrà等[30]研究發現與S. cerevisiae純種發酵相比，假絲酵母（Candida zemplinina）純種發酵能顯著提高葡萄酒中2-苯乙醇含量，從而使得其高級醇含量顯著增高。在檢測到的醇類物質中，只有異戊醇含量超過感官閾值，是葡萄酒主要香氣貢獻物質[21]。與SC組相比，PK組酒樣中異戊醇含量顯著升高，提高21.26%。混合發酵處理酒樣中只有高比例接種處理（S10、S20）酒樣中異戊醇含量顯著提高，其中S20組物質含量最高，提高38.31%。此外余歡等[31]發現巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）純種發酵能夠提高葡萄酒中癸醇含量，給葡萄酒帶來橙子花香。本實驗也發現了類似結果，PK組酒樣中癸醇含量較其他處理顯著提高，3 組混合發酵處理葡萄酒中癸醇含量也較SC組顯著提高，且其含量隨著P. kluyveri接種比例的升高而降低。

酯類物質是葡萄酒果香和花香的主要貢獻者[28]。前人研究表明畢赤酵母屬酵母具有高產酯類物質的特性[3]。本實驗中，與SC組相比，3 組混合發酵處理酒樣中酯類物質總量均顯著提高，且隨著P. kluyvei所占比例的增加，酯類物質增幅越大。其中S20組酒樣酯類物質總量為74.08 mg/L，較SC組中酯類物質總量高出21.34%。這與Escribano等[32]報道畢赤酵母屬酵母具有高酯酶活性的結果一致。在檢出的19 種酯類物質中，丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯5 種物質的OAV均大于1，對所得酒樣香氣的貢獻更為顯著[21]。檢出19 種酯類物質，其中有5 種物質OAV大于1，分別為丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯。與SC組酒樣相比，不同比例混合發酵處理均可促進以上5 種酯類物質的合成，有利于葡萄酒果香和復雜性的增強[31]。其中，己酸乙酯具有最高的OAV（15.08～17.19），可以給葡萄酒帶來濃郁的草莓、菠蘿香氣[21]。S20組酒樣己酸乙酯質量濃度最高（429.73 μg/L），為SC組的1.06 倍，但S1、S10組與SC組間差異不顯著。Chua等[33]發現P. kluyvei在豆腐乳清發酵中能顯著提高發酵產物中乙酸異戊酯含量，賦予其香蕉香氣，這與本研究結果一致。此外乳酸乙酯能賦予葡萄酒特殊的乳香風味[32]，與SC組相比，PK組酒樣中乳酸乙酯含量較低，但混合發酵過程中乳酸乙酯含量顯著增加，其中S20組酒樣中乳酸乙酯含量最高（26.38 mg/L），為SC組（13.12 mg/L）的2.01 倍，這可能是因為混合發酵過程中酵母之間的互作促進了乳酸乙酯的生成。相關

研究表明，葡萄酒中香氣物質的生成在非釀酒酵母與S. cerevisiae共發酵體系中存在協同作用[34]。

表2 不同發酵處理葡萄酒的香氣成分Table 2 Volatile compounds identified from wines fermented with different starter cultures

葡萄酒中的脂肪酸能夠抑制對應芳香酯的水解，有利于葡萄酒香氣的平衡。其中低濃度脂肪酸能賦予葡萄酒奶酪、奶油風味，但含量過高時會給葡萄酒帶來刺激、腐敗等不良風味[28]。本實驗檢出的6 種脂肪酸含量均低于感官閾值，有利于提高葡萄酒的復雜性[28]。與SC組相比，各處理脂肪酸總量均降低，特別是各混合發酵處理中丙酸、異丁酸、異戊酸的含量均顯著降低，這與Lu Yuyun等[35]利用P. kluyvei和T. delbrueckii混合發酵榴蓮酒的結果一致。

在檢出的其他物質中，β-大馬士酮能夠貢獻葡萄酒中的甜香、花香和蜂蜜香[32]。本實驗中該物質在3 組混合發酵處理中含量較高，均超出感官閾值，但在SC組酒樣中并未檢測到，這可能與非釀酒酵母可產生較多的利于水解香氣前體物質的糖苷酶相關[2]。

圖3 干紅葡萄酒發酵香氣成分在前2 個主成分上的載荷及酒樣分布圖Fig. 3 Loading plot of wine aroma components on the first two PCs

為進一步判別不同處理之間香氣成分的差異，對所有發酵香氣成分進行PCA，結果如圖3所示。在PCA模型中，PC1（40.66%）和PC2（39.69%）的累計方差貢獻率為80.35%，能夠反映樣本的大部分信息。3 組混合發酵處理均位于PC1方向正端，其酒樣中辛酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯等香氣物質含量豐富，而SC組位于PC1方向負向端，酒樣中香氣物質含量相對較少。PC2可將混合發酵處理（S1、S10、S20）酒樣與PK處理酒樣顯著區分，主要貢獻物質為己酸異戊酯、1-辛醇和3-甲基-1-戊醇等。由此可知P. kluyvei和S. cerevisiae混合發酵改變了純種發酵時的呈香特征。

對酒樣中OAV大于0.1的物質進行香氣分組，選取∑OAV大于0.5的6 種香氣類型繪制得到葡萄酒的香氣輪廓圖（圖4）。所有實驗酒樣香氣均以果香為主，其次為花香、焦糖味、脂肪味、化學味、植物味。相較于SC組酒樣，接種P. kluyvei的葡萄酒樣中果香、花香及焦糖味均有顯著提高。這與混合發酵顯著提高了樣品中酯類、醇類及β-大馬士酮等物質含量有關。植物味、脂肪味及化學味在低濃度條件有利于提升香氣復雜度[21]，所有處理中植物味和化學味強度無顯著差別，但混合接種處理中脂肪味強度略有上升，這是由于混合發酵處理提高了葡萄酒中異戊醇、乳酸乙酯等物質的含量。

圖4 不同發酵處理干紅葡萄酒發酵香氣輪廓Fig. 4 Aroma profile of red wines produced with different tarter cultures

3 結 論

隨著對非釀酒酵母釀造特性研究的深入開展，其在改善葡萄酒風味中的積極貢獻被不斷挖掘，與S. cerevisiae混合發酵作為有潛力的工藝措施也得到了廣泛的關注。本研究選擇本土P. kluyveri HS-2-1與S. cerevisiae NX11424以不同比例順序接種釀造赤霞珠干紅葡萄酒，發現HS-2-1和NX11424以20∶1比例接種，在確保乙醇發酵順利完成的同時，能夠最大限度地發揮P. kluyveri的產香特性，顯著提高發酵酒樣中己酸乙酯、丁酸乙酯等乙基酯類物質含量，使葡萄酒的果香和花香顯著增強。因此，本研究認為本土P. kluyveri HS-2-1具有增香釀造葡萄酒的應用潛力。在后續研究中，將進一步細化其與S. cerevisiae的互作關系及對葡萄酒品質指標的全面影響，以期為葡萄酒增香釀造工藝技術的研發提供重要理論依據。