不同取代度水溶性羧甲基茯苓多糖的制備、結構表征及體外抑菌活性

別 蒙，謝筆鈞，孫智達*

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf）是一種寄生在松樹根部的真菌，在中國有2000多年的食用歷史，是我國重要的藥食兩用藥材之一[1]。茯苓在食品工業以及醫藥行業用途廣泛，具有利尿、安神、健脾等功效，常用于治療水腫、失眠、心神不安等癥[2-3]。

茯苓多糖為茯苓的主要有效成分，其中90%以上為堿溶性多糖，不溶于水，且基本沒有生理活性，生物利用率極低，使之在臨床應用上受到限制[4]。但是將不溶于水的堿溶性茯苓多糖經過適當的化學修飾后，可提高其水溶性和生物活性[5]。因此，目前有關茯苓多糖的水溶性修飾（如羧甲基化和硫酸酯化及水溶性低聚體等）以及多糖的活性與結構的關系，已成為國內外研究的熱點和核心問題[6]。研究表明，羧甲基化修飾的茯苓多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等[7]。根據Wang Yongjiang等[8]報道，茯苓多糖羧甲基化后能提高對膽汁酸的結合能力。Wang Yufen等[9]通過氣相色譜-質譜聯用、核磁共振等技術對羧甲基化與硫酸酯化Lachnum多糖進行了結構表征與活性研究，證實羧甲基化與硫酸酯化修飾都能顯著提高多糖抗氧化和降血糖活性。本實驗室研究發現，茯苓多糖經羧甲基化修飾后，水溶性增強，對腸道健康也具有一定的促進作用，其抑制腸毒素大腸桿菌的能力顯著提高，并且與蓮房原花青素（lotus seedpod procyanidins，LSPC）協同使用時能有效解決多酚低濃度促進大腸桿菌生長的負效應[10]。然而，關于茯苓多糖羧甲基化程度與理化性質、結構及生物活性關系的研究較少，尤其是有關羧甲基化程度與其體外抑菌活性之間的研究并不完善[11]。本研究采用二次堿化法制備羧甲基茯苓多糖（carboxymethylated pachymaran，CMP），通過單因素試驗和正交試驗得到最佳改性工藝，并對不同取代度（0.350～0.728）的CMP進行理化性質分析、結構表征與體外抑菌活性研究，以期為進一步研究CMP作為天然抗菌劑提供科學基礎，進而促進堿溶性茯苓多糖的合理深加工，提高其利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白茯苓購自湖南省懷化縣茯苓基地；LSPC由實驗室自提，蓮房采自洪湖藍田種植區，品種名稱為“武植2號”。

無水乙醇、氫氧化鈉、一氯乙酸、冰醋酸、PAN指示劑（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；金黃色葡萄球菌C M C C(B)2 6 0 0 3、大腸桿菌NCTC12900、腸炎沙門菌BNCC103134、Luria-Bertani（LB）肉湯、LB瓊脂、Mueller-Hinton（MH）肉湯中國青島霍普生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海東璽制冷儀器設備有限公司；SHZ-D（III）型循環水真空泵 武漢科爾儀器設備有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計上海尤尼柯儀器有限公司；Nexus 470 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；DSC204F型差示掃描量熱儀 耐馳儀器上海有限公司；DAWN HELEOSII型多角度激光散射儀（配備Optilab T-rEX型示差檢測器）美國A g i l e n t公司；AV 6 0 0核磁共振儀 德國Bruker公司；JSM-6930LV掃描電鏡 日本NTC公司；Multskan Go全波長讀數儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 CMP的合成

采用二次堿化法[12]，稱取一定量脫脂后的茯苓多糖于錐形瓶中，倒入一定量的不同體積分數的乙醇，在不同溫度下，攪拌溶脹0.5 h，再加入固體氫氧化鈉，繼續攪拌堿化反應2 h，再向錐形瓶中加入同樣質量的氫氧化鈉和一定質量的固體醚化試劑一氯乙酸，繼續進行攪拌。結束反應后，混合物用冰醋酸調節pH值到6.0±0.2，隨后進行抽濾，用80%乙醇溶液洗滌至濾液中無Cl-，固體用50 ℃烘箱烘干至質量恒定，得到CMP。

1.3.2 單因素試驗

固定反應時間5 h、乙醇體積分數80%、反應物（茯苓多糖、氫氧化鈉與一氯乙酸）物質的量比1∶3∶1.5，考察反應溫度分別為50、55、60、65、70 ℃對CMP取代度的影響。固定反應溫度60 ℃、乙醇體積分數80%、反應物物質的量比1∶3∶1.5，考察反應時間分別為3、4、5、6、7 h對CMP取代度的影響。固定反應溫度60 ℃、反應時間5 h、反應物物質的量比1∶3∶1.5，考察乙醇體積分數分別為70%、75%、80%、85%、90%對CMP取代度的影響。固定反應溫度60 ℃、反應時間5 h、乙醇體積分數80%，考察反應物物質的量比分別為1∶2∶1、1∶2.5∶1.25、1∶3∶1.5、1∶3.5∶1.75、1∶4∶2對CMP取代度的影響。

1.3.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，每個因素選取3 個水平，以CMP取代度為考察指標，設計正交試驗，見表1，并利用SPSS分析正交試驗結果，確定最佳合成工藝，并進行驗證。

表1 CMP改性正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on modification of carboxymethyl pachyman

1.3.4 CMP取代度的測定

采用銅鹽絡合滴定法[13]測定。其原理是基于CMP上的羧基官能團可以定量和銅離子發生沉淀反應，該法簡便快速，準確可靠。

1.3.5 不同取代度CMP的結構表征

1.3.5.1 紫外-可見光譜分析

配制1.0 mg/mL的不同取代度的CMP溶液，用超純水作參比，用UV-2100型紫外-可見分光光度計在200～800 nm波長條件下進行掃描[14]。

1.3.5.2 紅外光譜分析

準確稱取不同取代度的CMP 10 mg，與已干燥的500 mg KBr混合，在瑪瑙研缽中研磨均勻，取50 mg研磨后的粉末進行壓片，利用Nexus 470 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀于4 000～400 cm-1波數范圍內進行掃描，分析CMP的特征基團[15]。

1.3.5.3 Zeta電位與粒徑分析

Zeta電位是指剪切面的電位，是表征分散體系穩定性的重要指標。用去離子水將不同取代度的CMP配制成質量濃度為0.5 mg/mL的溶液，于Zetasizer Nano ZS納米粒度電位分析儀上測定CMP的Zeta電位，測量溫度25 ℃，每組數值重復3 次取平均值。將不同取代度的CMP配制成0.5 mg/mL的多糖溶液，于Zetasizer Nano ZS納米粒度電位分析儀上測定CMP的粒徑分布，測量溫度25 ℃，每組數值重復3 次取平均值[16]。

1.3.5.4 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[17]，準確稱取0.100 0 g葡萄糖（105 ℃烘干恒質量），配成10 mg/mL的葡萄糖溶液，再吸取上述溶液1.0 mL用蒸餾水定容至100 mL，得到0.100 0 mg/mL葡萄糖標準溶液。精密量取上述標準溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL于25 mL比色管中，補加蒸餾水至5 mL，搖勻。分別吸取1 mL供試液于具塞試管中，用苯酚-硫酸法在波長490 nm處測紫外吸光度，記錄數據，制作標準曲線。將不同取代度CMP樣品溶于水，配成適當質量濃度的供試樣品溶液，吸取1 mL樣品溶液，依照上述顯色條件，于波長490 nm處測定吸光度，根據葡萄糖標準曲線換算CMP中的葡萄糖質量濃度，根據式（1）計算CMP中總糖質量分數：

式中：c為供試液中葡萄糖質量濃度/（mg/mL），由標準曲線換算所得；b為稀釋倍數；V為樣品總體積/mL；m為樣品質量/mg。

1.3.5.5 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法[18]測蛋白。準確稱取10.00 mg牛血清白蛋白標準品，用蒸餾水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的蛋白質儲備液，吸取上述溶液1 mL，定容至10 mL，配制成0.1 mg/mL的蛋白質標準溶液，備用。分別吸取蛋白質標準溶液0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.72、0.84、0.96 mL于10 mL比色管，補充蒸餾水至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍貯備液，搖勻，靜置5 min，于595 nm波長處測紫外吸光度，記錄數據，繪制標準曲線。配制適當質量濃度的CMP溶液，吸取1 mL測定吸光度，代入標準曲線計算蛋白含量。

1.3.5.6 熱穩定性分析

差式掃描量熱分析：稱取樣品6～10 mg，于鋁坩堝中壓緊，以空鋁盒為參比，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍20～350 ℃。在N2中進行測定[19]。

1.3.5.7 分子質量測定

采用凝膠色譜與多角度激光光散射聯用儀檢測不同取代度CMP的分子質量[20]。將CMP樣品用0.1 mol/L NaNO3配制成質量濃度為2.0 mg/mL的溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣量200 μL。色譜條件：PL aquagel-OH MIXED色譜柱（7.5 mm×300 mm，8.0 μm），檢測溫度25 ℃，流速0.8 mL/min。

1.3.5.8 單糖組成分析

采用氣相色譜法分析不同取代度CMP樣品的中性單糖組成[21]。

CMP樣品水解及衍生化：稱取10 mg干燥樣品于具塞試管中，加入3 mol/L三氟乙酸溶液4 mL，使多糖完全溶解后密封，于110 ℃烘箱水解6 h，向多糖水解液中少量多次加入甲醇并減壓蒸干，至三氟乙酸被完全蒸出。再分別準確稱取6 種單糖標準品各10 mg，向樣品水解物和單糖標準品中再分別加入10 mg鹽酸羥胺、1.5 mg肌醇和1.0 mL吡啶并混合均勻，封口后于90 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫后加入乙酸酐0.50 mL，90 ℃條件下繼續反應30 min。冷卻后經0.45 μm微孔濾膜過濾并進樣。

氣相色譜條件：H P-5石英毛細管柱（30 m×0.53 mm，0.32 μm）；氫火焰離子檢測器；氣化室溫度250 ℃；檢測器溫度270 ℃；升溫程序：初始溫度190 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃，保持20 min；載氣N2；氮氣流量50 mL/min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量50 mL/min；分流比30∶1；進樣量1 μL。

1.3.5.9 核磁共振波譜分析

上樣質量濃度20 mg/mL，茯苓多糖以氘代二甲基亞砜為溶劑，CMP以D2O為溶劑，在600 MHz核磁共振譜儀上測定，參數如下：探針溫度60 ℃；掃描次數16；空掃次數0 次；脈沖角度30°；弛豫延遲時間1.0 s。

1.3.5.10 掃描電鏡的超微結構分析

取少量干燥的茯苓多糖及CMP粉末，用雙面導電膠將樣品黏到樣品臺，用濺射鍍膜法進行鍍金處理，厚度15 nm，在電壓15 kV，高真空條件下使用掃描電鏡對樣品進行微觀形貌分析[22]。

1.3.6 不同取代度CMP的抑菌活性

抑菌實驗用96 孔板微量二倍稀釋法[23]，挑取單菌落置于LB液體培養基，37 ℃搖床培養至對數期。活化好之后，根據麥氏比濁法0.5號管，用MH培養基將菌液濃度調節至108CFU/mL，再稀釋10 倍。將不同取代度的CMP配制為20 mg/mL樣液，LSPC配制為10 mg/mL樣液，將LSPC和CMP按1∶1比例（m/m）混合，在96 孔板中加入200 μL樣液，采用二倍稀釋法將每種樣品稀釋為8 個梯度，之后再加入100 μL MH培養基，10 μL菌液，使每個孔最終菌濃度為5×105CFU/mL，每種樣品質量濃度為10～0.078 125 mg/mL。茯苓多糖以無菌二甲基亞砜為溶劑，以同等質量濃度的二甲基亞砜為對照。樣品對照組以培養基代替菌液，陰性對照用培養基代替樣品溶液，陽性對照用芐氨青霉素代替樣品溶液。每個質量濃度設置3 個平行，于37 ℃培養箱中培養12 h，于全波長讀數儀上測定其吸光度。按式（2）計算抑制率：

式中：A0為空白培養基吸光度；AS為樣品對照組吸光度。

2 結果與分析

2.1 CMP制備的單因素試驗結果

圖1 單因素試驗結果Fig. 1 Results of one-factor-at-a-time experiments

如圖1A所示，在一定的溫度范圍內，羧甲基的取代度先上升后下降，當反應溫度到65 ℃時，羧甲基的取代度最高。結果表明，提高反應溫度可以促進羧甲基化反應，但溫度過高會破壞多糖的結構[24]，導致羧甲基化程度降低，因此，CMP達到最高取代度時合成的最佳反應溫度為65 ℃。如圖1B所示，隨著反應時間的延長，羧甲基取代度也隨之增高，在5 h后增加速度減緩，6 h后趨于平穩。反應時間的延長有助于多糖充分溶脹，但從節能環保的角度出發，選擇6 h作為CMP的最佳反應時間。如圖1C所示，在一定的乙醇體積分數范圍內，羧甲基取代度隨著乙醇體積分數的增加而增大，在乙醇體積分數為85%時，羧甲基取代度達到最大值，但繼續增加乙醇體積分數，羧甲基取代度反而降低。這是因為羧甲基取代反應的實質是氫氧化鈉和一氯乙酸反應生成的氯乙酸鈉進攻茯苓多糖的活性中心，當乙醇體積分數較高時，氫氧化鈉的濃度增大，進攻活性中心的反應更劇烈，反應產物取代度也較高而當乙醇體積分數過高時，少量水分使得醚化試劑向茯苓多糖活性中心遷移的速率下降，取代度也隨之下降，因此，CMP合成的最佳乙醇體積分數為85%。如圖1D所示，羧甲基的取代度在一定范圍內穩步上升，當反應物物質的量比從1∶2∶1變為1∶3∶1.5時，羧甲基取代度快速增大，隨后繼續增加反應物物質的量比水平時，羧甲基取代度變化平緩。這是因為氫氧化鈉和一氯乙酸達到一定濃度時會發生副反應[25]，反應效率隨之下降，因此，CMP合成的最佳反應物茯苓多糖、氫氧化鈉、一氯乙酸的物質的量比為1∶3∶1.5。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交試驗設計與結果

在單因素試驗結果基礎上，考察反應物物質的量比（A）、乙醇體積分數（B）、反應時間（C）、反應溫度（D）對茯苓多糖羧甲基化取代度的影響，結果見表2。各因素對取代度的影響由大到小依次為A＞D＞B＞C，反應的最優組合為A3B2C1D3，因此，反應的最佳條件為反應物物質的量比1∶3.5∶1.75、乙醇體積分數80%、反應時間4 h、反應溫度65 ℃。

表2 CMP改性工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of modification of carboxymethyl pachyman

2.2.2 驗證實驗

在理論最優條件A3B2C2D2下進行3 次平行實驗，取代度分別為0.639、0.617、0.651，平均取代度為0.636，在正交試驗中最優反應條件A3B2C1D3下進行了3 次平行實驗，取代度分別為0.724、0.729、0.718，平均取代度為0.724，要高于理論最優條件A3B2C2D2下的0.636，因此，選擇實驗A3B2C1D3為最優取代工藝。

2.3 不同取代度CMP的制備

正交試驗優化條件下得到的CMP的取代度普遍較高（＞0.5），為增大對CMP取代度的研究范圍，選用單因素與正交試驗中制備CMP的反應條件，通過控制反應條件，制備6 個不同取代度的CMP。CMP-1：反應溫度50 ℃、反應物物質的量比1∶3∶1.5、反應時間5 h、乙醇體積分數70%，取代度為0.350；CMP-2：反應溫度60 ℃、反應物物質的量比1∶3∶1.5、反應時間5 h、乙醇體積分數70%，取代度為0.448；CMP-3：反應溫度60 ℃、反應物物質的量比1∶3∶1.5、反應時間4 h、乙醇體積分數80%，取代度為0.501；CMP-4：反應溫度60 ℃、反應物物質的量比1∶3∶1.5、反應時間5 h、乙醇體積分數80%，取代度為0.591；CMP-5：反應溫度60 ℃、反應物物質的量比1∶3∶1.5、反應時間5 h、乙醇體積分數90%，取代度為0.666；CMP-6：反應溫度65 ℃、反應物物質的量比1∶3.5∶1.75、反應時間4 h、乙醇體積分數80%，取代度為0.728。

2.4 不同取代度CMP理化性質的分析

2.4.1 紫外-可見光譜分析

圖2 不同取代度CMP紫外-可見光譜圖Fig. 2 UV-visible absorption spectra of CMP with different substitution degrees

如圖2所示，CMP在波長200 nm處有多糖的特征吸收峰，而在波長280 nm附近處有弱吸收峰，說明CMP含有少量蛋白質，為避免除蛋白造成對多糖的損失，本實驗暫未進行除蛋白研究，蛋白含量由考馬斯亮藍法測定。

2.4.2 紅外光譜分析

圖3 茯苓多糖、CMP的紅外光譜Fig. 3 IR spectra of pachyman and CMP

如圖3所示，茯苓多糖和CMP在2 900 cm-1附近處均有典型的多糖特征吸收峰（C—H），在3 700～3 000 cm-1處，較寬的吸收峰是羥基（—OH）的締合峰，1 640 cm-1（C＝O的非對稱伸縮振動）和1 420 cm-1（次甲基的伸縮振動）附近處是羧甲基的特征吸收峰，說明發生了羧甲基化反應。890 cm-1附近為β-吡喃糖特征峰，從圖3可看出，890 cm-1處，茯苓多糖的特征峰最為明顯，CMP-1稍弱，CMP-2～CMP-6幾乎沒有β-吡喃糖特征峰。結果表明取代度越高，峰強度越大，表明羧甲基化程度越高，β-吡喃糖特征峰逐漸減弱直至消失。

2.4.3 Zeta電位與粒徑分析

如圖4A所示，不同取代度的CMP始終帶負電荷，說明CMP屬于陰離子多糖，同樣表明羧甲基化成功。隨著取代度的上升，CMP電位的絕對值也不斷增大，證明CMP所帶的電荷隨著取代度的增加而增大。從電位層面分析，CMP是陰離子多糖，并且其溶液的穩定性隨著取代度的增大而增大。有研究證實抗菌劑的抗菌活性與其Zeta電位有關[26]，抗菌劑電荷分布可能會進一步影響細菌細胞壁的電位分布。

如圖4B所示，隨著取代度的增加，CMP的粒徑先增大后減小。羧甲基基團的引入，一方面使得CMP的結構變得舒展，另一方面，較高的取代度有助于發生聚合。Chen Lingyun等[27]的研究證明羧甲基殼聚糖在水溶液中有很強的聚集性，其聚集行為取決于其取代度。取代度在0.501之前，粒徑隨著取代度的增加而急劇增大。然而，在水溶液中，CMP帶有負電荷，且取代度越高，電位絕對值越高，因此，顆粒間靜電斥力增強，使CMP在水溶液中的聚集行為減弱，多糖鏈壓緊收縮，所以在取代度大于0.501之后，粒徑又開始大幅減小。

圖4 不同取代度CMP溶液的Zeta電位（A）與粒徑（B）分析Fig. 4 Zeta potential (A) and particle size (B) analysis of CMP solutions with different substitution degrees

2.4.4 不同取代度CMP中的中性糖組成和蛋白含量分析

表3 不同取代度CMP的總糖含量與蛋白含量Table 3 Total sugar and protein contents of CMP with different substitution degrees

由標準曲線得總糖回歸方程y=9.38x+0.088（R2=0.997 8）。如表3所示，隨著取代度的增高，CMP中總糖含量下降。有研究證實茯苓多糖羧甲基化后，β-吡喃糖特征峰變弱，β-糖苷鍵C3質子峰消失[28]。本實驗也由紅外光譜與核磁波譜分析結果得到了證實。

由標準曲線得蛋白回歸方程y=6.110 5x+0.009 4（R2=0.998 3）。如表3所示，蛋白含量變化與CMP的取代度無明顯關系，且所含蛋白很少。

2.4.5 不同取代度CMP的熱穩定性分析

圖5 不同取代度CMP的熱穩定性分析Fig. 5 DSC analysis of CMP with different substitution degrees

由圖5可知，未經羧甲基化的茯苓多糖在127 ℃左右出現一個吸熱峰，對應樣品的晶區熔融；在311 ℃左右出現一個放熱峰，對應于樣品的受熱碳化。相應的，所有經過修飾后的CMP的吸熱峰和放熱峰對應茯苓多糖，均向右移動，可見，羧甲基改性提高了茯苓多糖的熱穩定性。其中，230～260 ℃是羧甲基的分解峰，該溫度范圍內，羧甲基發生斷裂，脫去羧基和羰基[29]。茯苓粉在此溫度范圍內無峰，也說明了羧甲基反應的成功。值得注意的是不同取代度的CMP熱穩定性也有較大差別，在一定范圍內，取代度增高，CMP的熱穩定性也增高，當取代度超過0.591時，CMP的熱穩定性反而隨著取代度的增高而降低。這可能是因為取代度的升高使得CMP顆粒破碎，發生裂解。

2.4.6 分子質量分布

表4 不同取代度CMP的分子質量Table 4 Molecular mass distribution of CMP with different substitution degrees

由表4可知，樣品的mw、mn隨取代度的增加而降低。這可能與衍生化反應條件的劇烈程度有關，反應條件越劇烈，茯苓多糖的分子結構被破壞的越嚴重，最終導致分子鏈的斷裂從而導致分子質量的減少[30]。

2.4.7 氣相色譜分析

如圖6所示，該多糖為均一多糖，僅由D-葡萄糖這一種單糖組成。

圖6 標準單糖（A）與CMP-6（B）的氣相色譜圖Fig. 6 GC chromatograms of mixed standards of monosaccharides (A) and CMP-6 (B)

2.4.8 核磁共振分析

圖7 茯苓多糖（A）與CMP-6（B）13C NMR譜圖Fig. 7 13C NMR spectra of pachymaran (A) and CMP-6 (B)

表5 樣品與葡聚糖殘基的13C NMR的化學位移Table 5 Chemical shifts of pachymaran, CMP and dextran residues in 13C NMR spectra

如圖7A所示，6 個顯著的葡萄糖殘基上C的化學位移峰。在δ100～115之間，僅有1 個異頭碳的峰，茯苓多糖C1的δ為103.55，說明只有一種單糖，根據出峰的位置和相關文獻報道[31]值，確定為葡萄糖。而羧甲基化后的茯苓多糖（CMP-6）C1的δ相對于改性前的茯苓多糖，從δ103.55移動到了δ102.34，也只顯示了1 個異頭碳的信號峰（圖7B）。表明茯苓多糖與CMP-6都只存在唯一一種糖殘基[32]。CMP-6其余的13C-NMR譜圖中的δ與文獻[31]報道的β-1,3-葡聚糖支鏈十分一致。圖7B中，原未改性的多糖中C3（δ86.73）峰消失，而在δ82～85出現的一系列信號峰為C2、C4、C6取代對C3的影響[33]。說明取代反應在C2、C4、C6位上都有發生。圖7B中，C5信號峰從δ76.83位移至δ75.54，說明羧甲基衍生化反應主要發生在C6位羥基，并使C5的峰略向高場移動[34]。圖7B中部分原茯苓多糖的信號峰由于羧甲基化而向低場移動，從C6（δ61.36）位移至δ70.14（C6’），這是由于在C6上—CH2COOH基團取代了羥基，C6從δ61.36向低場（左區域）轉移[33]。改性后茯苓多糖的C4部分信號峰從δ68.90移至δ68.02，C2部分信號峰從δ73.33移至δ73.28，進一步說明衍生化反應也發生在C4和C2羥基位。δ178.05的新信號峰為羧甲基上C＝O的碳信號。綜上分析可認為，茯苓多糖與CMP-6主要由β-1,3-葡聚糖組成，從這些峰的面積來看，對應取代量，羧甲基的引入程度為C6＞C4＞C2。

2.4.9 超微結構分析

圖8 茯苓多糖及不同取代度CMP的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM pictures of CMP with different substitution degrees and pachymaran

由圖8可知，未經處理的茯苓多糖顆粒間隙大，表面光滑；羧甲基衍生化后，顆粒間較為緊實，且隨著取代度增加，顆粒間聚集程度增大，結構越緊密。這可能與多糖結構中的羧甲基根有關，由于羧甲基根的極性與離子強度較大，所以分子間相對作用力較大，導致顆粒形成聚集體[35]。并且隨著取代度越大，顆粒表面越粗糙，并伴隨著裂痕的出現，當取代度在0.591時，顆粒破碎，出現一定程度的裂解，在取代度為0.728時，裂解情況更加嚴重，這說明羧甲基化影響茯苓多糖的結構排列，合成過程中劇烈的反應條件造成的形態破壞是合理的，從掃描電鏡分析可知，CMP-6的裂解情況最為嚴重，影響了茯苓多糖的結構排列，所以，當取代度超過0.591時，CMP的熱穩定性反而降低。

2.5 不同取代度CMP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌的抑菌作用

如圖9所示，同一取代度時，抑菌活性與多糖呈濃度依賴性，多糖質量濃度越高，抑菌效果越好，且同一質量濃度下，不同取代度CMP的抑菌率不同，羧甲基化程度越高，抑菌活性越大。結果表明，在CMP質量濃度為10 mg/mL時，取代度為0.728的CMP對金黃色葡萄球菌的抑制率能達到60.91%，取代度為0.350的CMP在10 mg/mL時對金黃色葡萄球菌的抑制率也能達到35.88%，這說明CMP對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，并且CMP的取代度是影響其抑菌性的重要指標之一。對大腸桿菌的抑制強度隨著CMP取代度的增高而增強，最大抑菌率可以達到35.55%，在1.25 mg/mL之后趨于平緩，同時遠低于同質量濃度的芐氨青霉素對大腸桿菌的抑制率，因此反映出CMP對大腸桿菌的抑制效果較差。而CMP對腸炎沙門菌最高的抑制率僅能達到7.80%，低質量濃度的CMP反而促進腸炎沙門菌的生長，陽性對照在低濃度時也無抑菌效果。而且取代度越低，促進腸炎沙門菌生長的情況越明顯。這可能是由于腸炎沙門菌將多糖當作碳源。結果說明，CMP對腸炎沙門菌無抑菌效果。并且茯苓多糖對3 種菌無明顯抑制效果，也不促進菌的增殖，說明茯苓多糖無體外抗菌作用。結果表明，CMP與LSPC混合物的抑菌效果要強于單獨的LSPC，且能明顯改善LSPC在低質量濃度下促進腸道菌增殖的負效應。如LSPC在0.04 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的增殖率為40%，而與CMP復配后，同樣的濃度下，不同取代度CMP與LSPC混合物均不會使其增殖，相反，有明顯的抑制效果，與CMP-6復配時其抑制率達到30%。高取代度的CMP與LSPC的復配物在低質量濃度下對腸炎沙門菌也無負效應，證實了取代度越高的CMP與LSPC的復配效果越好。綜上表明，CMP的抑菌作用具有選擇性，對革蘭氏陰性菌的抑菌效果較弱，且抑菌所需要的質量濃度較大，實驗室已證實多糖與多酚協同使用比單獨的多糖或多酚抑菌效果更好[36]，且能大大減少多糖用量，因此可以與多酚聯合使用。

圖9 CMP及LSPC復配物對金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸桿菌NCTC12900、沙門菌BNCC103134的抑制率Fig. 9 Inhibition rates of CMP and LSPC and their mixture against S. aureus CMCC(B)26003, E. coli NCTC12900 and Salmonella enteritis BNCC103134

3 結 論

通過單因素試驗與正交試驗設計探究CMP的最佳合成工藝為反應時間4 h、反應溫度65 ℃、乙醇體積分數80%、反應物茯苓多糖-氫氧化鈉-一氯乙酸物質的量比1∶3.5∶1.75；進行驗證實驗，得到CMP的平均取代度為0.724，優化工藝準確可靠。隨后，通過控制反應條件制備出不同取代度的CMP，并對CMP-1～CMP-6進行理化性質鑒定和結構表征。

紫外掃描結果表明CMP含有少量蛋白，而蛋白含量與CMP的取代度無關。紅外光譜分析表明，CMP具備多糖的特征吸收峰，Zeta電位分析與粒徑分析結果表明CMP為陰離子多糖，且取代度越高，電位絕對值越高，粒徑先增大后減小，溶液越穩定。中性糖分析結果表明，隨著CMP取代度的增高，其中性糖含量下降。差示掃描量熱分析結果表明其熱穩定性在一定取代度范圍內先增加后降低，掃描電鏡分析與凝膠色譜分析表明CMP的取代度越大，空間結構越緊密，裂解情況越嚴重，從而導致其分子質量隨取代度的增大而減小。結構分析顯示茯苓多糖與CMP為以β構型的吡喃糖環，主要由β-1,3-葡聚糖組成，且衍生化反應主要發生在C6位羥基。

采用茯苓多糖及不同取代度的CMP、LSPC及其復配物對3 種食源性致病菌進行抑菌實驗，結果表明，茯苓多糖沒有抑菌作用，而CMP有抑菌作用，其取代度越高，其抑菌效果越好。與LSPC復配使用時能有效解決LSPC在低濃度促進腸道致病菌增殖的難題，且取代度越高，復配的效果越好。CMP對革蘭氏陽性菌的抑菌能力高于革蘭氏陰性菌。這可能是因為陽性菌的細胞膜比陰性菌敏感，取代度高的CMP水溶性及電位絕對值均較高，能破壞細菌的細胞膜，但抑菌作用需要濃度較高，因此需要對多糖與多酚協同抑菌作用及其可能的機制進行進一步的研究。