生物絮團系統在氮轉化過程中的微生物多樣性變化

秦海鵬，王 博，廖栩崢，胡世康，趙吉臣，何子豪，楊世平，孫成波

(廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江，524088)

生物絮團技術(BFT)具有降低飼料系數、提高養殖動物存活率并能減少養殖污水排放等特點，可以有效解決當前水產養殖業發展所面臨的飼料成本和環境污染等問題[1]。BFT能在零或低水交換率的條件下改善養殖水體有毒有害無機氮的積累[2]。氨氮脅迫對生物絮團模式的養殖功效的影響，證實了生物絮團具有清潔水質、促進蝦生長和生理健康的作用[3]。不同蛋白水平對生物絮團模式的養殖有不同的功效，生物絮團可以顯著提高養殖系統中對蝦的生理健康水平，減少病害的爆發，阻絕病害的傳播等[4-5]。養殖水體菌群組成直接影響對蝦的生長發育和健康狀態[6-7]，在物質循環、拮抗病原、調節水質與維持育苗系統穩定等方面發揮積極作用[8-9]。生物絮團模式的養殖水體中微生物群落與活性污泥的微生物群落會受到營養物質、溫度、鹽度、化學需氧量和溶氧的影響[10]。目前，國內應用BFT進行水產養殖的研究開始由試驗階段過渡到中試規模的養殖試驗[11-12]。盡管生物絮團被廣泛應用在零換水工廠化循環水養殖模式中，但其仍存在不少問題，其作用機理尚不明確，與生物絮團系統的微生物結構與多樣性的動態變化相關的研究不足。高通量測序技術可以靈敏地探測環境微生物多樣性，實現宏基因組水平上多重樣品間的平行比較研究[13]，全面地指示對蝦健康狀態與菌群特征關系[14-16]。通過高通量測序分析生物絮團系統在氮轉化過程中微生物多樣性的變化，旨在為生物絮團系統在工廠化循環水養殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在設有防逃網的0.3 m3的藍色塑料桶中進行，水體體積250 L，生物絮團從鹽度25的養殖池中用200目的篩絹網撈取。經過1周時間暫養的日本對蝦，體長(9.20±0.04) cm，體質量(9.53±0.71)g。

1.2 試驗設計

試驗在廣東海洋大學水產學院東海島海洋生物研究基地進行。將日本對蝦隨機分為2個試驗組，每組3個重復，飼養密度250 尾/m3；對照組水體為清潔的消毒海水，日換水量20%。試驗組在消毒海水中加入初始量為20 mL/L的生物絮團，試驗周期為30 d，24 h連續充氣。

1.3 水樣收集

在30 d試驗期間，每天測定氨氮，亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，水質生化分析收集的水樣(100 mL)在真空壓力下通過0.45 μm GF/ C濾紙過濾。

1.4 水體菌群取樣和DNA提取

根據水質測定結果取試驗組第1天、第10天和第30 天水樣(分別標記為Cb、Zb和Qb)，水樣使用無菌瓶收集，通過0.2 μm孔徑的聚碳酸酯過濾器(Millipore Corporation，USA)過濾100 mL的混合物以獲得微生物樣品。使用Omega EZNA Water DNA試劑盒(Omega Bio-Tek，USA)從微生物樣品中提取總基因組DNA。通過使用特異性引物擴增16S rRNA基因的V4區：515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3')。將PCR產物(320～350 bp)再循環以構建擴增子文庫，然后在Miseq平臺(Illumina，USA)上進行測序。

1.5 序列數據分析

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，對樣品的reads進行拼接，經過過濾操作，得到高質量的Tags數據(Clean Tags)。基于Clean Tags進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類(OTU分析)[17]。根據OTUs聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度(統計，可視化)、Alpha多樣性分析等，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等[18-19]。

1.6 水質測定方法與數據分析

氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮質量濃度根據《養殖水環境化學實驗》測定[15]。所有數據采用Graphpad Prism8.0軟件統計分析，用SPSS 19.0進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 生物絮團系統養殖過程中的氮轉化

氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮在系統中的轉化過程如圖1所示。

圖1 生物絮團系統中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的變化

在試驗過程中，對照組的水體微生物無法有效轉化多余的殘飼糞便，無機氮逐漸累積[20-21]。隨著試驗的進行，水體中的氨氮呈先升高后降低的趨勢。對照組氨氮始終高于試驗組，試驗組氨氮在第5天達到最大質量濃度(2.99 mg/L)，之后在第9天降低至趨于0 mg/L；對照組在第9天達到最大質量濃度(7.51 mg/L)，之后在第26天降低至趨于0 mg/L。表明生物絮團能促進水體中的氮轉化進程[22]。亞硝酸鹽氮在試驗組中產生和去除的時間少于對照組，試驗組在第17天達到最大質量濃度(12.54 mg/L)，之后在第28天降低至趨于0 mg/L；對照組的亞硝酸鹽氮質量濃度在試驗周期30 d內呈不斷升高的趨勢，在第30天達到13.42 mg/L。氨氮與亞硝酸鹽氮在水體中呈先升高后降低的趨勢，這與其他相關研究結果[4]相同。氨氮的累積快于亞硝酸鹽氮的累積，更快于硝酸鹽氮[23]，分析水體中氨化細菌的繁殖要快于亞硝化細菌與硝化細菌[24]。試驗組的硝酸鹽氮質量濃度高于對照組，在第30天兩組分別達到19.56和6.31 mg/L。據報道，在鹽度為35的水體中，斑節對蝦對硝酸鹽氮的耐受性高達232 mg/L[25-26]。試驗結果顯示，從第13天到第22天出現的降溫也影響到了氮轉化進程，水體中氨氮與亞硝酸鹽氮的質量濃度均出現停滯，相關研究[27]也證明了溫度對生物絮團的影響。

2.2 水體菌群豐度和多樣性

如圖2所示，利用 16S rRNA 基因 V3+V4 區域 illumina 測序從水體微生物群落中獲得了3 500個OUT(操作分類單元)，Cb、Zb和Qb分別為1 932、2 209和2 023個OUT，3個試驗組之間具有907(25.9%)個共同的OUT。采用 ace、chao1和observed otus計算了基于OUT的菌群豐度指數，并采用shannon和simpson評估菌群多樣性指數，ace、chao1、observed otus和simpson的豐度隨養殖周期的增加均顯著增加，shannon多樣性在Zb期最高，Cb期最小，不同時期差異顯著(表1)。

圖2 不同時期的水體菌群韋恩圖

表1 不同時期的水體菌群多樣性指數

注：同列中標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性(P>0.05)

2.3 不同時期的水體菌群組成差異

共鑒定出23個門549個屬。如圖3A所示，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)是主要的細菌，在試驗周期中變形菌門(Proteobacteria)相對豐度隨時間增加而降低，擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門相對豐度隨時間增加而增加。如圖3B所示，在屬水平上，Ardenscatena、冷蛇菌屬(Psychroserpens)、Inquilinus和Marinicella是最主要的細菌，三價鐵和硝酸鹽還原細菌、冷蛇菌屬和Marinicella相對豐度隨時間增加而增加。如圖3C所示，與氮轉化有關的主要的菌有Ardenscatena、硝化螺旋菌(Nitrospiraceae)、亞硝化單胞菌(Nitrosomonadaceae)、Ardenscatena、Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae相對豐度隨時間增加而增加，氨氧化古菌相對豐度隨時間增加而降低。其中，Ardenscatena屬內菌種，能夠將硝酸鹽氮還原至亞硝酸鹽氮，參與水體氮循環過程。氨氧化古菌屬的分類歸于古生菌，可以將氨氧化成亞硝酸鹽氮[28]。在上述菌屬協同作用下，生物絮團能有效調控水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮[29]。與氮轉化有關的菌的豐度隨水體中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的質量濃度變化而變化。生物絮團系統在培育過程的不同時期既存在著共有種屬，同時也存在著各自獨特的微生物種屬，微生物種屬之間的協同和競爭作用，形成了特定的生態位群落結構[30]。

圖3 不同時期在門水平(A)、屬水平(B)以及與氮轉化(C)相關的水體菌群相對豐度

在門水平上變形菌門和擬桿菌門是主要的細菌，在所有類型的生物絮團中占很大比例。這與楊章武等的研究結果相類似[31]。在試驗周期中變形菌門相對豐度隨時間增加而降低，擬桿菌門、綠彎菌門和放線菌門相對豐度隨時間增加而增加。水體中大多數變形菌門是養殖系統中的共生細菌[32]。在生物絮凝物的廢水處理中，變形菌門用于去除有機物質[33-34]。變形菌門在生物絮團細菌組成中起著重要作用[35-36]。因此，在凡納濱對蝦的生物絮團養殖模式下，變形菌門的存在可以有效調節水產養殖水體的水質。放線菌門是一種常見的益生菌，可以在特定環境中產生有益物質[37]。

2.4 不同時期水體菌群種類和豐度差異及距離矩陣PCoA

在圖4中根據加權和未加權UniFrac距離矩陣PCoA圖分析，可知同組樣本之間物種可以很好地聚在一起，不同組之間可以清楚地分離出來。

圖4 不同時期水體菌群的加權UniFrac距離矩陣PCoA圖

通過LDA值分布柱狀圖分析，得到不同組間微生物分類相對豐富的差異。如圖5所示，LEfSe的LDA值計算結果顯示，具有顯著差異的細菌群落在Cb組中最多且相對豐度最大，Zb組最少且相對豐度最小，菌群豐度隨著時間的增加，先減少后增加[28-29]。可以得出，經過培養的穩定的生物絮團系統中，水體菌群的多樣性有所減少、豐度有所增加，這與夏耘等[30]的研究結果相似。根據結果分析， 原因應該是穩定的系統中水體優勢菌群

圖5 不同時期水體菌群的LDA值分布柱狀圖

的豐度進一步增加，在全部菌群中占據更大的比例。根據LDA值分布柱狀圖的結果可以得出，經過培養的穩定的生物絮團系統中，水體菌群的多樣性更為豐富，穩定后的生物絮團系統與剛接種時的生物絮團系統相比，水體菌群的結構發生了顯著變化。

3 結論

生物絮團系統在培育過程中，通過微生物群落間的演替作用，實現群落類型的穩定及自身功能的穩定與可持續。生物絮團系統的微生物群落結構與多樣性在水體氮循環過程中存在變化情況，通過高通量測序分析生物絮團系統在氮轉化過程中水體菌群的多樣性變化，結果顯示，經過培養的穩定的生物絮團系統中，水體菌群的多樣性有所減少、豐度有所增加，菌群涉及氮轉化相關的關鍵屬在不同時期具有顯著變化。因此，在生物絮團系統養殖模式的應用中，穩定的生物絮團培養需要一定的時間，從而為水體中與氮轉化相關的水體微生物的演替提供時間和物質環境的準備，提高對生物絮團系統的有效利用。

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