池塘沉積物對上覆水脫氮作用的初步探究

2020-07-04 02:17:20付賢茂羅國芝劉文暢譚洪新

漁業現代化 2020年3期

付賢茂，羅國芝,2,3，劉文暢，譚洪新,2,3

(1 上海海洋大學，上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；2上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點試驗室，上海 201306；3上海海洋大學，水產科學國家級試驗教學示范中心，上海 201306)

氮循環是水產養殖生態系統物質循環的一個重要組成部分。養殖活動中，飼料等輸入的氮量占整個養殖系統總氮輸入量的90%[1]。但其中只有不到25%的氮被養殖對象轉化到體內，大約有30%總氮(TN)以殘飼、糞便形式進入池塘水體或沉積物中[2]。沉積物作為養殖池塘氮和其他元素的集中地，脫氮生物群落在其中扮演著重要角色[3]。沉積物不但能夠吸附水體中的氮、磷、硫等元素，調節水體水質狀況，而且是益生菌以及底棲生物生長繁殖的場所。但是沉積物積累會逐漸敗壞水質、釋放硫化氫等有毒物質[4-5]。一般采用曬塘和挖掘方法去除沉積物和污染物，但是這種方式無法避免更深層的氮素再礦化，挖掘出來的沉積物也會對環境造成污染[6]。因此，基于生物脫氮的原位修復方法可能更安全和更經濟[7]。

以堿度為調控因子，研究池塘沉積物上覆水的脫氮效果和微生物群落，初步分析其脫氮規律以及微生物特性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

1.2 試驗沉積物反應器設置

采用12個室內玻璃纖維反應器(直徑30 cm，高50 cm，工作體積15 L)開展試驗，設置A組(對照組)、B組、C組、D組，每組3個重復。每個容器接種10 cm攪拌均勻的沉積物樣品。試驗廢水采用人工配水[13]，并通入N2使溶氧達到1.5～2.0 mg/L。為避免攪動沉積物，使用虹吸法向每個反應器加入2 L人工配水。反應器用錫箔紙密封避光，試驗用小蘇打(NaHCO3)調控堿度，各組投加量：A組0 mg/L，B組300 mg/L，C組500 mg/L，D組700 mg/L；初始堿度(以CaCO3計)分別為(143.3±7.10)mg/L、(275.2±22.01)mg/L、(385.1±28.01)mg/L和(466.5±61.50)mg/L。

1.3 檢測方法

R=(C1-C2)/C1×100%

(1)

總DNA提取及PCR擴增：使用DNA提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用 Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測。以 20～30 ng DNA為模板，使用PCR引物擴增原核生物16SrDNA上包括V3及V4的2個高度可變區。上游引物序列為(CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT)，下游引物為(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC),PCR擴增體系(25 μL)TransStart Buffer2.5 μL，dNTPs.2 μL，primers.1 μL × 2，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板DNA 20 ng，ddH2O補至總體積25 μL。PCR 反應參數：預變性參數94 ℃ 3 min × 1，變性參數94°C 5 sec，退火參數 57 ℃ 90 sec，延伸72 ℃ 10 s，終延伸參數72 ℃ 5 min，共進行24個循環。

高通量測序：采用Illumina MiSeq測序系統對采集的底泥樣品進行高通量測序。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 上覆水脫氮作用的影響

表1 試驗期間沉積物水處理效果

圖1 試驗期間總氮(a)、氨氮(b)、亞硝酸鹽氮(c)及硝酸鹽氮(d)的動態變化

試驗期間堿度變化如圖2所示。A組試驗過程中堿度維持穩定，但是B、C和D組堿度均呈下降趨勢，最終分別降至(160.66±17.70)mg/L、(191.53±25.09)mg/L和(226.89±20.23)mg/L。

圖2 試驗期間各組堿度動態變化

2.2 沉積物微生物群落動態分析

高通量測序鑒定出門水平微生物群落相對豐度如圖3所示。

圖3 初始沉積物組與試驗組優勢菌群在門水平上的分布

初始沉積物與試驗組系統中主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和Epsilonbacteraeota。其中，變形菌門(68.1%±2.95%)豐度相對較高，占主導地位。而經試驗馴化綠彎菌門與酸桿菌門相對豐度降低，分別從初始相對豐度9.48%，5.27%降低至5.7%，2.58%。硝化螺旋菌門隨著試驗時間的增加，其相對豐度也隨之增加。但試驗組與對照組微生物群落之間無明顯差異(P>0.05)，而與初始沉積物有顯著性差異(P<0.05)，這可能是因為試驗環境與池塘環境略有不同導致。

圖4所示為沉積物屬水平微生物相對豐度，其中硫桿菌(Thiobacillus)、(f__Steroidobacteraceae_Unclassified)和硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)為主要優勢菌屬。未鑒別菌屬(Unclassified)相對豐度比例為10.77%～11.07%。其中硫桿菌(Thiobacillus)和Sulfurimonas是一類常見的自養型脫氮硫桿菌，主要與硫自養反硝化有關。值得注意的是，在試驗組中發現了硫堿螺旋桿菌屬(Thioalkalispira)(5.6%)，其相對豐度比初始沉積物(0.4%)較高。f__Steroidobacteraceae_Unclassified(12.6%)在初始沉積物中占主要優勢菌種，但試驗組在馴化其相對豐度顯著下降至4.3%。