G 蛋白偶聯受體激酶5 與非小細胞肺癌的臨床相關性

陳本超，李 恒，劉 超，王書廷，李高峰

（昆明醫科大學第三附屬醫院胸外二科，云南昆明 650100）

肺癌全球高發，嚴重威脅人民健康，肺癌的發病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首[1]。根據組織病理學特性，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 是肺癌的一個類別，在肺癌中NSCLC 占其中85%的比例[2-3]。雖然目前極大的推廣了肺癌的早診早治理念，但仍有大部分NSCLC患者確診時已屬于晚期，目前對于晚期肺癌的主要治療方法仍以內科治療為主[4]。但伴隨近年來腫瘤分子靶向治療和免疫治療的潛入研究，靶向藥物以其局部殺傷的高效性及安全性備受關注，對于有基因突變的晚期NSCLC 患者，靶向治療已逐漸成為一線用藥的首選[5]。然而部分患者通過基因檢測未發現相應靶基因突變，對于這部分患者臨床上仍然以傳統的放化療為主要治療方式，因此探求一種新的相對廣譜的靶點已成為目前治療肺癌的熱點研究。

G 蛋白偶聯受體激酶5（G protein-coupled receptor kinases 5，GRK5） 是GRKs 家族其中一種亞型，其通常分布于身體各個器官組織，尤其在肺和心臟中有較高表達，有研究表明GRK5 是多種疾病以及惡性腫瘤的調控蛋白[6-7]。雖然GRK5 在惡性腫瘤的發生發展中具有重要作用，但是GRK5 在非小細胞肺癌中的作用機制研究鮮有報道。本研究擬利用免疫組織化學法探究NSCLC 中GRK5 的表達情況，并研究其與NSCLC 患者臨床關聯性，以期能為臨床NSCLC 的治療提供新的藥物靶點和新的預后指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料收集昆明醫科大學第三附屬醫院（云南省腫瘤醫院） 胸外二科2017年8月至2018年12月176例手術切除的NSCLC 癌巢組織蠟塊及其癌旁組織蠟塊。蠟塊對應患者基本臨床信息見表1，本課題已通過倫理委員會審查，所有患者術前均已簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑GRK5 抗體（NO.ab64943，abcam 公司，英國），動物非免疫血清（羊） （SP KIT-B3，邁新公司，福州），ABC 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（NO.K5007，Dako 公司，丹麥）

1.2 方法

免疫組化檢測NSCLC 中GRK5 的表達將組織蠟塊用輪片切片機切成4 μm 制成病理切片，嚴格按照烤片、二甲苯脫蠟、各級濃度乙醇水化、3%過氧化氫溶液處理、5%羊血清封閉、GRK5 一抗（濃度1:1 000） 孵育過夜、ABC 法染色、蘇木素復染、各級濃度乙醇脫水、中性樹膠進行封片等免疫組化實驗步驟。由兩位副主任病理醫師對組織標本的免疫組化染色切片分別在顯微鏡下參照標準Fromowitz 方法進行評估，如果對同一病理切片的病理評價結果有差異，則由兩位醫師同時在雙頭顯微鏡下進行再次評估和商議后，確定最終結果。

表1 非小細胞肺癌患者臨床病例特征［n（%）］Tab.1 Clinical characteristics of patients with non-small cell lung ［n（%）］

1.3 統計學處理

本研究實驗數據采用SPSS 統計學軟件分析，以α=0.05 作為檢驗水準，其中率的比較進行卡方檢驗（Chi-Square test），多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較作獨立樣本t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 數據庫（http://kmplot.com） 進行分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁組織中的表達情況

在176例NSCLC 患者癌巢中，其中92例GRK5 陽性表達，陽性表達率52.27%，84例陰性表達，陰性表達率47.73%；在患者癌旁肺組織中，其中64例GRK5 陽性表達，陽性率36.36%，112例陰性表達，陰性表達率63.64% （圖1），GRK5在NSCLC 癌巢中的陽性表達率相較于癌旁肺組織高，經統計學分析P=0.003，差異有統計學意義，見表2。

圖1 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁組織中表達結果Fig.1 GRK5 expression in tumor nests and adjacent tissues of NSCLC

表2 GRK5 在NSCLC 癌巢及癌旁組織中的表達情況［n（%）］Tab.2 Expression of GRK5 in tumor nests and adjacent tissue of NSCLC ［n（%）］

2.2 GRK5 在非小細胞肺癌組織中的表達與臨床的關聯性

在176例NSCLC 患者中，共有124例肺腺癌，其中72例陽性表達，陽性率58.06%，52例陰性表達，陰性表達率41.94%；共有52例肺鱗癌，其中20例GRK5 陽性表達，陽性表達率38.46%，32例陰性表達，陰性表達率61.54%，GRK5 在肺腺癌中的陽性表達率較鱗癌高，經統計學分析差異有統計學意義（P=0.018），見表3。而本研究中GRK5 的表達與NSCLC 患者的年齡、性別、病理分期、腫瘤大小、淋巴結是否轉移等無臨床關聯性（P＞0.05）。

2.3 GRK5 在非小細胞肺癌中的表達與患者預后的關聯性

通過Kaplan-Meier Plotter 數據庫對1 926例肺癌患者進行生存分析，結果顯示GRK5 高表達患者中位生存時間為63 個月，而GRK5 低表達患者中位生存時間為77.77 個月，高表達患者總生存時間（overall survival，OS） 顯著低于低表達患者OS，差異有統計學意義（P=0.001，HR 1.24，95%CI 1.09～1.4）。同時在肺腺癌中GRK5 高表達也提示不良預后（P=0.000 3），而在鱗癌中GRK5 的表達與預后無相關性（P=0.65），見圖2。

表3 GRK5 在NSCLC 組織中的表達與組織學類型的臨床關系［n（%）］Tab.3 The clinical relationship between GRK5 expression and histological types in NSCLC ［n（%）］

圖2 GRK5 在非小細胞肺癌中的表達與總生存期的相關性Fig.2 The correlation between GRK5 expression and overall survival in NSCLC

3 討論

GRK5 是GRKs 家族其中一種亞型，其通常分布于身體各個器官組織，主要表達于細胞質膜上，尤其在肺和心臟中有較高表達，在其他實體組織器官中也可檢測到微量GRK5 表達[12]。有學者研究發現，GRK5 可以直接或間接調節G 蛋白偶聯受體及其下游蛋白信號分子從而參與相關疾病或腫瘤的信號轉導[13]。在GRK5 基因敲除小鼠中，p53 的蛋白水平以及DNA 損傷導致的胸腺細胞凋亡均有升高[14-15]，這些研究表明，GRK5 不僅與心血管系統疾病的發生發展有相關性[16]，同時在腫瘤的增殖、分化中可能具有重要的作用。

本實驗研究結果顯示，GRK5 主要在NSCLC癌巢及癌旁肺組織的細胞膜和細胞質表達，而信號調節通路中的關鍵蛋白往往位于細胞膜，且已有研究表明GRK5 可以調控前列性腫瘤、腎細胞癌以及膠質瘤的生長[17-18]，由此筆者分析GRK5 可能是肺癌增殖、分化等相關調節信號通路中的重要蛋白。在本實驗176例NSCLC 中，GRK5 在NSCLC 癌巢中的表達顯著高于癌旁肺組織，同時通過生存分析結果顯示GRK5 高表達肺癌患者OS 顯著低于低表達患者，該生存分析結果與我們的實驗結果一致，由此可以分析GRK5 可能促進NSCLC 細胞的異常分化、增殖等。有研究表明，這可能與GRK5 能夠抑制p53 依賴的細胞凋亡和G1 期阻滯有關[15，19]。在與臨床特征關聯性分析中發現，GRK5 在腺癌中的表達高于鱗癌，而與其他臨床特征無相關性，生存分析結果顯示在肺腺癌中GRK5 高表達提示不良預后，而在鱗癌中GRK5 的表達與預后無相關性。綜上筆者可以得出結論，GRK5 在NSCLC 中可能是一個促癌因子，NSCLC 的增殖、分化等可能與它的過表達有關，尤其是在肺腺癌中。筆者的研究結果與已有相關研究結果相一致[20]。因此未來筆者有望將GRK5 作為肺腺癌的特異性腫瘤分子標志物或藥物靶點，從而為肺腺癌的診斷和治療提供新的分子標志物和靶點。

雖然本研究探討了GRK5 在NSCLC 中的表達與臨床及預后的相關性，但筆者需要更大樣本免疫組化驗證以及進一步的細胞學和動物學實驗探索其在NSCLC 的分化、增殖、凋亡中的作用及其內在機制。因此，本研究的意義在于為進一步研究GRK5 在NSCLC 中的發病機制提供了基礎方向，為NSCLC 的診斷、治療和預后提供了潛在的新靶點。