氧化鋅/多孔石墨烯電化學免疫傳感器檢測食管癌腫瘤標志物CEA

景愛華，李 宇，許 瓊，馮文坡

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一種重要的廣譜腫瘤標志物，常用作早期診斷結腸癌和乳腺癌的特異性標志物，也與其他腫瘤標志物聯合檢測用于食管癌、肺癌及其他惡性腫瘤[1-5]。CEA的高靈敏檢測在癌癥的早期診斷和篩選疾病復發中扮演重要的角色。許多專業的檢測手段，如放射免疫分析法、化學發光分析法、酶聯免疫法等已經用于CEA的檢測[6-8]。與傳統的免疫方法相比，電化學免疫法因靈敏度高、成本低、檢測速度快、易于實時原位檢測吸引了更多的關注。石墨烯復合材料在免疫傳感器領域的應用已屢見不鮮[9]，例如Dong等[10]通過金納米粒子固定水溶性石墨烯量子點，Zhu等[11]用金納米粒子復合石墨烯，王麗娟等[12]使用金納米顆粒和有機物殼聚糖來復合石墨烯，Huang等[13]利用Ag/Au納米顆粒來包覆石墨烯，Wang等[14]用硫堇(Thi)/金納米粒子(AuNPs)來修飾氨基官能石墨烯(NH2-G)，Liu等[15]采用金納米粒子/離子液體功能化還原氧化石墨烯(IL-rGO-AuNPs)復合材料來修飾電極，對CEA進行檢測。

此外，復合材料因其結合多種材料的優點而在生物傳感領域備受矚目。納米氧化鋅(Zinc oxide，ZnO)是一種寬帶隙半導體材料，具有生物相容性好、在生理環境中化學穩定性相對良好、比表面積大等優點，在光學、光電子學、傳感器等領域有著廣泛的應用[16-18]。

本研究中，首先獲得多孔石墨烯(HGO)，隨后采用濕化學法將ZnO納米粒子生長在HGO表面，構建了一種ZnO/HGO復合材料的電化學傳感器，通過抗原抗體之間特異性結合實現對CEA的高靈敏檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)，三電極體系：工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極，鉑絲電極為對電極；FD-ID50冷凍干燥機(北京盛超科創生物科技有限公司)；JEOL JSM IT100掃描電子顯微鏡(SEM)；D8 ADVANCE X射線衍射儀(XRD)。CEA抗體(anti-CEA)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)購于上海生工生物工程公司，磷酸鹽緩沖溶液由0.1 mol·L-1Na2HPO4和0.1 mol·L-1KH2PO4配制，其他試劑均為分析純，使用前未經純化處理，實驗用水為去離子水。

1.2 HGO的制備GO和HGO都按照以前本實驗室發表文獻中所示方法獲得[9]。GO通過改良的Hummer法制得，具體如下：首先，低溫時將3 g KMnO4加入石墨、NaNO3、H2SO4混合液中(質量比為3∶1∶85)。接著，在35 ℃保持1 h，然后加入40 mL蒸餾水，0.5 h后，加入0 ℃蒸餾水100 mL。最后，加入5 mL H2O2(30%)，用5%的稀鹽酸和蒸餾水洗滌至溶液的pH值接近6。將產物于真空60 ℃條件下干燥，得到的褐色固體即為氧化石墨烯。重分散于一定的蒸餾水中超聲分散處理30 min。靜置后取上層清液，即得GO。HGO的制備：將5 mL 30%的H2O2溶液與50 mL 2 mg·mL-1的GO溶液混合，然后在100 ℃的溫度下加熱并攪拌2 h。之后離心、洗滌、重分散，最終制得2 mg·mL-1的深色HGO懸浮液，備用。

1.3 ZnO/HGO復合物的制備ZnO/HGO復合物的獲得是通過采用水熱法在HGO表面生長ZnO納米顆粒。首先將制備好的HGO 50 μL滴在玻碳電極表面，然后置于40 ℃烘箱內烘干。然后面朝下放置在0.05 mol·L-1Zn(NO3)2-NH3H2O (V/V,1∶1)混合液200 mL中，60 ℃恒溫一定時間。

1.4 電化學免疫傳感器的制備將ZnO/HGO/GCE修飾電極置于anti-CEA溶液(0.3 ng·mL-1)中，4 ℃下孵育12 h。接著，將電極浸于質量分數為0.25% BSA(w/w)溶液中，在37 ℃下孵育40 min ，封閉非特異性吸附活性位點。最后放入CEA溶液中，37 ℃下孵育1 h，即制得電化學免疫傳感器并置于4 ℃的冰箱中保存待用。

2 結果

2.1 材料的表征對所制備的ZnO/HGO材料進行表征。圖1中片層堆積的HGO表面，覆蓋顆粒狀ZnO，ZnO/HGO整體呈現比較有序的致密堆疊結構。結構間有空隙，形成三維狀，可以有效增大修飾電極表面積。XRD衍射圖如圖2，其中，ZnO/HGO衍射峰中31.6°、34.5°、35.1°、47.1°、56.7°、62.6°為ZnO的衍射峰，分別對應于(100)、(002)、(101)、(102)，(110)、(103)。這些峰與ZnO的六方纖鋅礦晶體結構(JCPDS文件編號99-0111)完全一致[19]。表明水熱生長在HGO表面上的ZnO具有比較高的晶體質量。

2.2 修飾電極的電化學行為CV和電化學EIS是考查電極表面常用的電化學檢測方法。圖3-4是玻碳電極(GCE)和修飾了ZnO/HGO、anti-CEA、BSA、CEA后的CV和EIS圖。從圖3中，當電極上依次修飾上ZnO/HGO/GCE(a),anti-CEA(b)，BSA(c)和CEA(d)后，峰電流逐漸降低。這是由于隨著anti-CEA，BSA和CEA修飾在電極表面，這些生物分子不導電，阻礙了電子在這些分子界面的傳遞，導致氧化還原峰電流隨著修飾步驟進展而逐漸降低。圖4中可以看出，隨著玻碳電極表面逐步修飾了ZnO/HGO、anti-CEA、BSA、CEA后，EIS譜中容抗弧半徑越來越大，這也是因為anti-CEA、BSA、CEA等蛋白質生物分子不導電，阻礙了電極表面電子的有效傳遞過程，從而在極化電阻上顯示出逐漸增大的情況。該結果同圖3所示CV的結果相對應，表明免疫傳感器順利制備出來。

圖1 ZnO/HGO掃描電鏡圖

圖2 ZnO/HGO和HGO的XRD衍射圖

a-d：ZnO/HGO/GCE、anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、CEA/BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE圖3 不同修飾電極的CV圖

a-d：ZnO/HGO/GCE、anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE、CEA/BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE圖4 不同修飾電極的EIS圖

2.3 不同實驗條件的影響

2.3.1 pH的影響分別考察在pH 6.8～7.6的PBS溶液中，免疫傳感器的電流響應情況。如圖5可見，在pH 6.8～7.4范圍內，電流隨著pH 的增大而增大，pH 7.4時電流峰值達到最大；當pH由7.4增大到7.6時，峰電流又隨著pH的增大而降低，峰電流在pH7.4時達到最大值，這和體液環境的pH相似。在實驗過程中，選擇pH 7.4的測試底液。

圖5 pH的影響

2.3.2 CEA孵育時間的影響傳感器于相同濃度的CEA 標準溶液中孵育不同時間的電化學響應情況如圖6所示，隨著孵育時間延長，抗原與抗體結合量逐漸增大，響應增強，在40 min后，傳感器響應情況趨于平衡，抗原抗體的結合達到飽和。選擇孵育時間為40 min。

2.4 傳感器的響應特性在優化條件下，利用免疫傳感器對不同濃度的CEA進行測定，記錄它們的差分脈沖伏安信號。從圖7可見，隨著CEA濃度的增加，CEA/BSA/anti-CEA/ZnO/HGO/GCE免疫傳感器的峰值電流也逐步增加。圖8為電流響應隨CEA濃度變化的線性關系圖，校準曲線顯示峰電流變化值與CEA的對數濃度在0.1～40 ng·mL-1范圍內呈現良好的線性關系，線性方程分別為，△I=5.95+1.48 log CCEA(ng·mL-1)，相關系數為0.9932(S/N=3)，檢出限為0.07 ng·mL-1。將本方法與文獻報道的方法進行了比較，見表1。結果表明，本研究制備的傳感器與其他研究具有相似的靈敏度、線性范圍和檢出限。

圖6 CEA孵育時間的影響

圖7 免疫傳感器對不同濃度CEA的DPV響應(0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10、20和40 ng·mL-1)

圖8 免疫傳感器對CEA的校正曲線

表1 不同文獻報道免疫傳感器檢測CEA比較

2.5 特異性、重現性和穩定性本研究引入了幾種人體環境可能存在的干擾物來探討該免疫傳感器的特異性，包括L-半胱氨酸(L-Cysteine)、甲胎蛋白(AFP)、葡萄糖(Glucose)、牛血清蛋白(BSA)、人免疫球蛋白(human IgG)、尿酸(UA)。檢測情況如圖9所示，CEA濃度低(1 ng·mL-1)時獲得檢測信號的強度遠遠高于其他干擾物質濃度高(50 ng·mL-1)時的信號強度(n=5)，這表明使用該免疫傳感器測定CEA時，干擾物質不會對CEA的測定產生干擾，免疫傳感器特異性良好。重現性是評價免疫傳感器性能的一個重要指標。本實驗中，使用相同的方法制備5支免疫傳感器，分別用于測定10 ng·mL-1CEA，所得的峰電流的相對標準差為3.6%，可見該免疫傳感器重現性良好。此外，研究發現，該免疫傳感器在4 ℃下保存2周后，仍舊能夠保留原電流響應強度的96%，可見其穩定性良好。

圖9 免疫傳感器的特異性

2.6 樣品測定用所制電化學免疫傳感器測定食管癌患者血清樣品，取PBS溶液稀釋10倍的血清樣品進行測定，結果如表2所示，相對標準偏差3.5%～5.7%，回收率93.4%～103.2%。說明該方法測定食管癌患者血清中的CEA含量，所得結果準確可信。

表2 樣品測定

3 討論

本實驗利用ZnO/HGO構建了一種新型的CEA電化學免疫傳感器。首先通過濕化法獲得多孔石墨烯(HGO)，這是一種二維基面上具有納米級孔隙的碳材料，它不僅能提高物質運輸效率、增大了比表面積、增多了活性位點，還能夠有效地防止石墨烯的團聚，隨后采用濕化學法將ZnO納米粒子生長在HGO表面，構建了一種ZnO/HGO復合材料的電化學傳感器，將ZnO寬帶隙、生物相容性好、在生理環境中化學穩定性相對良好、比表面積大等優點，與石墨烯優良的導電性、活性電位結合起來，具有較大的比表面積、優良的生物相容性以及良好的催化作用，不僅大大增加了生物分子的固定量，還顯著提高了傳感器的檢測靈敏度和穩定性。

隨后該研究將免疫學方法與電化學方法相結合，以[Fe(CN)6]3-/4-為電化學探針，通過抗原抗體之間高度的特異性結合實現對CEA的高靈敏檢測，取得了較寬的響應范圍0.1～40 ng·mL-1，較低的檢測下限0.07 ng·mL-1，最后將該免疫傳感器用于食管癌患者血清樣品中CEA的檢測，效果良好，相對標準偏差3.5%～5.7%，回收率93.4%～103.2%。說明該方法測定食管癌患者血清中的CEA含量，所得結果準確可信。與傳統的免疫方法相比，此免疫傳感器制作簡單、使用方便、成本低、靈敏度高、檢測速度快、易于實時原位檢測。在生物醫學、臨床診斷、健康檢測等方面具有潛在的應用價值。