TGF-β信號通路在食管癌中的作用

阮豪杰，許海軍，陳 攀，閆錦陽，高社干

在哺乳動物中，轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路能夠影響細胞分化、增殖、遷移、細胞外基質重塑、凋亡等多種生物學過程，參與胚胎發生、免疫調節、纖維化、傷口愈合、腫瘤進展等發育及病理學反應[1]。全世界每年確診的食管癌患者約為45萬人，死亡率在所有癌癥中位居第六位[2]。食管癌主要有兩種組織學亞型：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)，每種亞型均具有已知的危險因素和病理特征。ESCC占全世界食管癌病例的90%，但某些地區EAC的發病率正在上升，甚至超過了ESCC[3]。盡管最近在食管癌的診斷和治療方面取得了進展，但食管癌的預后仍然很差，5 a生存率約為15%～25%，主要是由于晚期食管癌已發生轉移才被確診[2]。因此有必要更好地了解食管癌的分子發病機制，以開發新的生物標志物和靶向治療方法。

1 TGF-β的激活及其受體

TGF-β超家族包括至少40個結構和功能相關的細胞因子，這些細胞因子參與胚胎發育、細胞外基質形成、免疫調節、炎癥、癌癥等多種生物學過程[4]。TGF-β激活的方式復雜多樣。首先，與TGF-β結合的延遲相關肽(latency-associated peptides,LAPs)在凝血酶素-1(thrombospondin-1,TSP-1)作用下構象發生變化[5]，隨后在轉化酶、血纖維蛋白溶酶、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等酶的共同作用下，TGF-β游離而激活[6]；其次，低pH水平的局部微環境或照射引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生可以激活TGF-β[7]；另外，肌成纖維細胞的機械收縮可以進一步激活潛在的TGF-β。上述這些機制導致具有生物活性的TGF-β釋放，從而結合TGF-β受體和下游信號分子激活。TGF-β家族蛋白根據結構特征可分為多種亞型，包括TGF-β、激活素/抑制素、骨形態發生蛋白/生長分化因子[8]。TGF-β受體傳導信號包括TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ和TGF-β RⅢ。在大多數組織中，TGF-β受體通過兩個TGF-β RⅠs和兩個TGF-β RⅡs形成異四聚體復合物來起作用[9]。

2 Smad依賴性的信號通路

TGF-β的信號傳導依賴于Smad蛋白家族。活性TGF-βⅠ與細胞表面的TGF-β RⅡ結合激活TGF-β RⅠ，進而使Smads(R-Smads)磷酸化。R-Smads包括Smad2和Smad3、R-Smad和Co-Smad分子在蛋白質的氨基端和羧基端有兩個保守的結構域，即MH1和MH2結構域、MH1和MH2結構域之間包含一個連接區結構域。TGF-βⅠ型受體的R-Smad磷酸化發生于SXS基序C端的兩個絲氨酸殘基。Smad 3和Smad 4能夠直接與保守的5’-CAGA-3’DNA結合基序相結合，但Smad2卻不含這個SXS基序。R-Smad與Smad 4形成異構體復合物是由MH2結構域介導的，該復合物的形成暴露了核輸入信號，同時屏蔽了核輸出信號，導致其在細胞核內積聚。在細胞核中，該復合物作為轉錄因子能夠與其他DNA結合轉錄因子、輔激活因子、抑制因子以及染色質重塑因子相互協同作用，激活或抑制下游靶基因的轉錄活性[10]。I-Smad7具有與R-Smads和Smad4 MH2結構域同源的羧基末端區域，可拮抗TGF-β受體/Smad信號活性。在基礎條件下，Smad7存在于細胞核，但在TGF-β誘導的受體復合物形成時，Smad7可易位至細胞膜[11]。Smad7能夠與激活的TGF-β受體復合物結合，從而阻斷R-Smads和激活的受體之間的相互作用，抑制下游信號的傳導。此外，Smad7還可在細胞核中與E3-泛素連接酶Smurf1或Smurf2相互作用，在TGF-β激活時，Smad7-Smurf復合物易位到細胞膜，誘導TGF-β受體泛素化及其蛋白酶體降解途經激活[12]。Smad7還可直接與DNA結合，競爭性拮抗Smad-DNA復合物形成，從而抑制TGF-β介導的轉錄活性[13]。

3 Smad非依賴性的信號通路

TGF-β信號傳導并不完全依賴Smads，因而進一步增加了TGF-β信號傳導的復雜性。TGF-β能夠誘導多種組織中上皮和內皮細胞Erk信號通路的激活，促進粘著連接的溶解和細胞遷移，該過程一方面通過間接活化TGFα及纖維母細胞生長因子自分泌循環[14]，另一方面是直接通過Src調節或通過TGF-β RⅡ自身磷酸化酪氨酸殘基[15]。此外，TGF-β RⅡ自身磷酸化酪氨酸殘基能夠激活SHCA，從而促進SHCA/Grb2/SOS復合物的形成。然后，該復合物通過C-RAF、MEK和ERK激活下游信號通路，激活細胞膜上的腎素—血管緊張素系統。TGF-β還可以依據細胞環境分別通過MKK4和MKK3/6促進JNK和p38-MAPK的激活，調節細胞凋亡或細胞遷移[16-17]。在上游，不是通過TRAF6介導的TAK1的富集，就是通過MAPKK KS、MEK1和MLK3磷酸化MKKs[18-19]。此外，PI3K/Akt信號通路亦介導一些TGF-β生物學功能。從機制上來看，PI3K的p85調節亞基似乎在結構上捆綁于TGF-βRⅡ，接近于復合物上富集TGF-β RⅠ激活PI3K和啟動下游信號的TGF-β刺激。TGF-β能夠以非依賴性的Smad2/3方式迅速激活RhoA和Cdc42/Rac1途徑，誘導肌動蛋白聚合參與EMT過程[20]。經典(Smad依賴性的)和非經典(非Smad依賴性的)TGF-β信號通路之間的交互作用有助于腫瘤的發展[21]。

在癌變和腫瘤進展中，TGF-β具有基礎性作用。然而，多數研究確定TGF-β在這一過程中具有雙重作用。腫瘤發生之前，TGF-β能夠抑制正常及癌前病變的上皮細胞生長。然而，由于腫瘤細胞中基因表達的增加和表觀遺傳改變，伴隨局部分泌的TGF-β水平的遞增，促進了侵襲和轉移的發生。因為TGF-β的功能取決于組織類型和遺傳背景，這進一步增加了其功能的復雜性[22]。

4 TGF-β與食管癌

食管癌是中國第五大惡性腫瘤，已成為中國癌癥死亡的第四大病因[23]。食管癌的危險因素包括吸煙、不良飲食習慣和維生素缺乏等[24]。通常，TGF-β家族配體與TGF-β受體胞外域結合后，觸發了經典Smad蛋白信號下游效應分子激活，導致了與組織穩態、腫瘤生長和進展相關的重要基因的轉錄[25]。有趣的是，TGF-β信號在調節腫瘤發生中似乎具有雙重作用：在早期階段它是一種生長抑制因子，但在晚期階段，TGF-β促進了腫瘤惡化和轉移[26]。這種雙重作用在ESCC和EAC中已證實。食管癌發生早期階段，TGF-β信號通路似乎對腫瘤的生長有抑制作用，EAC和ESCC細胞系均通過下調Smad4或c-Myc表達，而降低TGF-β反應性[27]。與此一致的是，Smad4在EAC的化生—增生—腺癌病變過程中表達逐漸減少，Smad4表達恢復后，對增殖的抑制能力恢復[28]。有趣的是，ESCC中TGF-β研究結果并不一致。DACH1甲基化導致TGF-β下調或Smad4表達降低，與浸潤深度增加、腫瘤分期晚和分化差有關[29-30]。 蛋白酶體降解引起的TGF-β下調實際上抑制了體內腫瘤的生長和侵襲[31]。盡管如此，針對ESCC患者的研究結果仍支持TGF-β的腫瘤抑制作用，信號傳導減少與更具侵襲性的腫瘤特征和更差的預后相關[32]。

在腫瘤發生晚期，TGF-β似乎具有促腫瘤作用。據認為，這種“轉換”主要是由中介蛋白質分子的丟失所介導的，而中介蛋白的丟失是適當控制TGF-β腫瘤抑制功能所必需的。例如，β2-spectrin(β2SP)是一種銜接蛋白，在細胞—細胞相互作用和維持上皮細胞極性中起著至關重要的作用。在EAC中，腫瘤細胞中β2SP的缺失導致SOX9和c-Myc的表達增加，而其他TGF-β靶標，如E-cadherin和細胞周期調節劑p21和p27的表達降低[33]。TGF-β還能激活成纖維細胞，這也有助于腫瘤浸潤、血管生成和EMT[34]。與健康對照組相比，食管癌患者的血清及腫瘤組織中TGF-β表達增高與腫瘤分期及預后有關[35]，并且TGF-β水平較高者，放療后血清TGF-β水平降低[36]。癌癥相關的成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在癌癥發生發展的多階段過程中發揮著非常重要的作用，CAF表達成纖維細胞活化蛋白-α和α-平滑肌肌動蛋白，是由癌細胞分泌的TGF-β等因子誘導[37]。最近的研究也表明，miRNAs參與成纖維細胞向CAFs的轉化[38]，這一發現在ESCC中得到了證實[39]。在這種狀態下，CAFs可以通過分泌活性因子與腫瘤或其他間質細胞通訊，激活促炎途徑，破壞免疫監視，改變細胞外基質，從而調節EMT[40]。血管內皮生長因子在ESCC中的表達與腫瘤大小有關[41]。另外，TGF-β的過表達和TβR的低表達與ESCC的浸潤深度和病理分期有關[42]。Smad4在ESCC中的表達與浸潤呈負相關[43]。Smad2的降解也可能導致ESCC腫瘤的發生和預后不良[44]。最后，TGF-β/Smad信號還能夠通過PTEN/PI3K促進ESCC的EMT發生[45-46]。總之，這些變異使TGF-β通過EMT促進腫瘤進展和最終轉移。實際上，在EAC和ESCC中，TGF-β信號通路激活增加晚期腫瘤分期，并與轉移、治療耐藥有關[47-48]。

microRNAs是多種癌癥診斷和預后的生物標志物之一，并可調節食管癌中的TGF-β信號[49]。miR-17/20a通過靶向TβR2和Smad錨定受體激活降解來抑制TCC-β/整合素β6亞基途徑，介導ESCC細胞遷移和侵襲[50]。此外，TGF-β在miR-455-3p介導的ESCC進展中起作用[51]。miR-655通過靶向TGF-β信號傳導所需的ZEB1和TβRⅡ來抑制ESCC進程并抑制EMT發生[52]。最近發現，miR-32通過CXXC5介導的TGF-β信號傳導抑制作用促進ESCC轉移過程[53]。

食管癌組織中異常表達的細胞骨架相關蛋白與TGF-β信號通路之間的相互作用可以促進ESCC的進展。在神經元遷移中起關鍵作用的Reelin負調節TGF-β誘導的ESCC細胞遷移。TGF-β通路通過轉錄因子Snail抑制Reelin的表達[54]。Fascin是一種肌動蛋白相關蛋白，可誘導細胞膜突起，通過TGF-β通路調節結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)和富半胱氨酸肝素結合蛋白61(cysteine-rich protein 61,CYR61)的水平，來促進ESCC細胞的增殖和侵襲[55]。CYR61和CTGF的過表達與ESCC生存不良有關[56]。Ezrin是一種細胞骨架交聯蛋白，也通過TGF-β和MAPK信號通路促進ESCC細胞增殖和侵襲[57]。上述研究結果表明，TGF-β信號可以在癌變前期抑制腫瘤的發生，在癌變的后期促進食管癌的發展和轉移。

5 展望

TGF-β通路在癌癥進展過程中發揮著重要作用，而且是公認的抗轉移治療的靶點。目前的臨床試驗集中于TGF-β活化阻斷劑、配體抑制物、針對TGF-β受體相互作用的中和抗體、反義寡核苷酸、TGF-β受體激酶活性的抑制劑等。然而，由于TGF-β腫瘤抑制作用取決于細胞微環境的變化，影響細胞因子復合物的功能，TGF-β信號作為一種治療策略必須慎重處理。