牙齦卟啉單胞菌感染的食管癌細胞外泌體中miRNA表達譜分析

朱夢璽，李洪超，王浩潔，徐娟娟，梁高峰,2，高社干,2

食管癌是一種發生在食管上皮組織的惡性腫瘤，是消化道中最具侵襲性的腫瘤之一，其發病率和死亡率分別居全球惡性腫瘤的第八位和第六位[1-3]。盡管對食管癌患者采用手術、放療、化療等綜合治療取得了一定的成效，但其預后較差，5 a生存率只有20%左右[4]，極大地影響了人們的健康和生活質量。食管癌有兩種主要的組織學亞型：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。與西方國家不同，我國是ESCC的高發地區，尤其是華北太行山脈地區，每年食管癌新增的患病人數占世界總患病人數的50%，其中患有ESCC的人數高達90%以上[5]。然而食管癌的發病原因尚不清楚，據推測，其病因與攝入亞硝酸鹽含量較高的腌菜和霉變食物，食用辛辣、滾燙的食物，吸煙、飲酒等不良的生活方式有關。近年來，越來越多的研究表明牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)與食管癌的發生發展密切相關。

P.gingivalis是一種口腔革蘭氏陰性厭氧菌，可以入侵上皮細胞，干擾宿主的免疫應答和細胞周期，進而引起牙周疾病和慢性牙周炎[6]。最近，Gao S等確定了P.gingivalis存在于ESCC患者食管上皮，并證實了P.gingivalis感染與ESCC嚴重程度和不良預后之間呈正相關[7]；Meng F等研究表明P.gingivalis可以促進ESCC細胞的增殖并誘導關鍵分子的表達[8]。然而P.gingivalis影響食管癌發生發展的具體機制尚不明確。

外泌體是細胞分泌的一類直徑在30～100 nm、密度為1.13～1.19 g·mL-1的胞外囊泡，富含一些標志性蛋白(如CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等)，主要成分包括脂質、核酸、蛋白質等[9-10]，廣泛存在于多種體液中，如血清、血漿、唾液等[11-13]。作為細胞間的信息傳遞者，外泌體可與腫瘤微環境相互作用，從而介導腫瘤的發生發展。基于外泌體的這一特性，本研究通過高通量技術對P.gingivalis感染的KYSE-30細胞外泌體進行測序，并且從中分別選取10個上調和10個下調的miRNA，在miRDB、miRwalk、TargetScan、miRTarBase 數據庫中預測其靶基因，并進行GO和KEGG富集分析，旨在研究P.gingivalis對食管癌細胞外泌體的miRNA表達譜及其相關信號通路的影響，并進一步探討P.gingivalis與食管癌miRNA之間的關系，為研究P.gingivalis影響食管癌發生發展的相關機制奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及菌株KYSE-30(人食管癌細胞系)購自中國科學院細胞庫；P.gingivalis菌株 ATCC 33277購自美國模式生物培養庫(American type culture collection,ATCC)。

1.2 細胞培養KYSE-30細胞及P.gingivalis感染的KYSE-30細胞在含有10% FBS(胎牛血清)、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養液中培養，并放置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養箱中常規培養。

1.3 細菌培養菌株ATCC 33277在含有5%羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K的GAM肉湯液體培養基中培養，并放置于37 ℃厭氧培養箱常規培養(85% N2、10% H2和5% CO2)。

1.4P.gingivalis感染KYSE-30細胞選取適量的活力較好的P.gingivalis菌液以MOI 10[14]的比例加入KYSE-30細胞培養基內，混勻即可(由于P.gingivalis為厭氧菌，在非厭氧環境中要盡可能快速操作以保證良好的細菌活力)。

1.5 外泌體的收集及Illumina HiSeqTM2500高通量測序分別收集KYSE-30細胞以及P.gingivalis感染的KYSE-30細胞的細胞培養液，采用超速離心法提取外泌體[15]。具體步驟如下：在4 ℃、2 000 g條件下低速離心10 min，去除細胞成分；將培養液上清在4 ℃、10 000 g條件下離心30 min，去除細胞碎片；取上一步的培養液上清，使用超速離心機在4 ℃、100 000 g條件下離心90 min，棄去上清液，用適量PBS(磷酸鹽緩沖液)重懸外泌體。將上述所得的外泌體樣品委托廣州市銳博科技有限公司進行高通量測序，提取KYSE-30細胞外泌體以及P.gingivalis感染的KYSE-30細胞外泌體中的總RNA，并分離小片段RNA，構建文庫，并在Illumina HiSeqTM2500平臺進行測序。

1.6 miRNAs及關鍵靶基因的篩選從測序獲得的miRNAs中分別篩選出10個上調的miRNA[log2(fold change) >1，P<0.05]和10個下調的miRNA[log2(fold change) <-1，P<0.05]，將篩選出的miRNA 輸入miRDB、miRwalk、TargetScan、miRTarBase 4個數據庫中進行相關靶基因的預測，篩選出所預測靶基因的交集，使用STRING在線工具(https://string-db.org/)對靶基因做PPI網絡分析，并使用Cytoscape 3.6.1軟件的插件cytoNCA計算Degree、Betweenness、Closeness等屬性值，并根據相關屬性值篩選關鍵靶基因。

1.7 相關靶基因的GO和KEGG富集分析基因本體論(gene ontology,GO) 功能富集分析包括以下3種類型：分子功能 (molecular function，MF)、生物過程 (biological process,BP)、細胞組分 (cellular component,CC)。將上述所得到的靶基因輸入Metascape在線分析工具[16](https://metascape.org/gp/index.html)，根據P<0.01，最小計數為3，富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計數與偶然預期的計數之間的比率)，進行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路分析。

2 結果

2.1P.gingivalis感染的KYSE-30細胞外泌體中差異表達的miRNA根據高通量測序所獲得的miRNA，以log2(fold change)>1，P<0.05為標準進行上調miRNA的篩選，log2(fold change) <-1，P<0.05為標準進行下調miRNA的篩選，各選10個miRNA并做miRNA上下調柱狀圖，結果如表1、圖1所示，其中紅色為上調miRNA，綠色為下調miRNA。

表1 20個差異表達miRNA的測序結果

注：“↑”表示上調，“↓”表示下調。

紅色:上調miRNA，綠色:下調miRNA。圖1 上調和下調的miRNAs

2.2 差異miRNAs與靶基因的相互作用將上述篩選出來的20個差異miRNA分別輸入miRDB、miRwalk、TargetScan、miRTarBase 4個數據庫中進行相關靶基因的預測，取4個數據庫所預測的靶基因的交集，去掉重復項，共501個靶基因，繪制Venn圖，結果如圖2所示。使用STRING在線工具(https://string-db.org/)對靶基因做PPI網絡分析，并使用Cytoscape 3.6.1軟件的插件cytoNCA計算Degree、Betweenness、Closeness等屬性值，并根據相關屬性值篩選關鍵靶基因，其中關鍵靶基因的篩選如圖3所示，篩選的關鍵靶基因如圖4所示。

2.3 相關靶基因的GO和KEGG分析GO功能富集結果表明，差異miRNA相關靶基因共富集GO條目859條，其中分子功能占106條，生物過程占666條，細胞組分占87條，根據P值分別篩選出前20條通路(見圖5-7)，其中主要參與的分子功能(見圖5)包括蛋白質結構域特異性結合、染色質結合、蛋白激酶結合、轉錄共調節因子活性、轉錄因子結合等；主要參與的生物過程(見圖6)包括血管發育、超分子纖維組織、積極調控細胞遷移、蛋白質去磷酸化、水解酶活性的正調控、細胞形態發生參與分化等；主要參與的細胞組分(見圖7)包括黏附連接、核體、皺褶、PcG蛋白復合物、細胞質區域等等。KEGG通路分析結果顯示，差異miRNA靶基因富集的通路共有31條，富集程度較高的前20條通路(見圖8)包括GnRH信號通路、TGF-β信號通路、Hippo信號通路、p53信號通路、Ras信號通路、mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞周期、細菌侵襲上皮細胞等。

圖2 根據4個數據預測的靶基因繪制的Venn圖

DC:Degree;BC:Betweenness Centrality；CC:Closeness Centrality。圖3 關鍵靶基因的篩選示意圖

圖4 篩選的關鍵靶基因

3 討論

P.gingivalis是引起人類牙周炎的一種主要致病菌，相關研究表明，P.gingivalis感染能引起動脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥。最近的研究發現P.gingivalis與食管癌密切相關[17]，而且P.gingivalis有可能是食管癌的高危因素，然而P.gingivalis引起食管癌的相關機制尚有待進一步闡明。最近研究表明，腫瘤細胞來源外泌體在腫瘤的演進過程中發揮著重要作用[18]。作為一種納米級(30～100 nm)的脂質雙層膜囊泡，外泌體可攜帶多種功能性分子，如脂質、核酸、蛋白質等，在細胞間自由穿梭，介導細胞間的通訊和信號傳遞[19-20]。本研究通過高通量測序技術研究了P.gingivalis感染的KYSE-30細胞外泌體中的miRNA表達譜，得到一批差異表達的miRNA，通過對差異miRNA靶基因的預測及GO和KEGG富集分析，進一步研究P.gingivalis是如何影響食管癌的發生發展的。

經高通量測序獲得的miRNA，以log2(fold change)>1，P<0.05及log2(fold change)<-1，P<0.05為標準分別篩選出10個上調和10個下調的差異表達的miRNA，并對其進行分析。通過miRDB、miRwalk、TargetScan、miRTarBase數據庫對其相關靶基因進行預測，使用STRING以及Cytoscape 3.6.1軟件的插件cytoNCA根據相關屬性值篩選關鍵靶基因，并進行GO和KEGG分析。本研究初步篩選到的關鍵靶基因如圖4所示，其中涉及STAT家族蛋白-STAT3以及與上皮-間質轉化相關的重要調控因子-ZEB1，而邵艷等[21]的實驗研究表明，STAT3與ZEB1在食管癌組織中的表達呈正相關，協同參與了食管癌的發展。這兩種不同研究方式，得到的研究結果相吻合。因此可以推測，P.gingivalis可能通過影響食管癌細胞中STAT3和ZEB1蛋白的表達進而參與食管癌的發生發展。

圖5 GO富集分析-分子功能

圖6 GO富集分析-生物過程

圖8 KEGG 通路分析

此外， GO富集分析表明P.gingivalis感染的KYSE-30細胞中的外泌體中的差異miRNA相關靶基因參與血管生成、積極調控細胞遷移、蛋白質去磷酸化、細胞形態發生參與分化、小GTP酶介導的信號轉導、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、ERK1和ERK2級聯等生物學過程。眾所周知，腫瘤的血管生成與腫瘤的生長及轉移密不可分，根據GO分析可以推測，P.gingivalis可能通過參與食管癌血管的重建從而影響食管癌的進展。GO結果顯示P.gingivalis感染的KYSE-30細胞中的外泌體中的差異miRNA相關靶基因可以積極調控細胞遷移，而本課題組前期通過實驗表明TGF-β1/Smad2通路可能參與了P.gingivalis-Exo促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲[22]，這與GO富集結果相一致。根據生物信息學預測分析，發現P.gingivalis也可能通過影響SMAD4蛋白的表達進而參與食管癌的演進，作者后期將通過實驗進一步驗證這些結果。KEGG通路分析結果表明P.gingivalis感染的KYSE-30細胞中的外泌體中的差異miRNA相關靶基因的信號通路包括GnRH信號通路、TGF-β信號通路、Hippo信號通路、p53信號通路、Ras信號通路、mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路等。本課題組之前的研究結果也表明，P.gingivalis通過miR-194使GRHL3、 PTEN 的表達下調，進而使 PI3K-Akt的表達上調，從而促進ESCC細胞的增殖和遷移[14]，其他通路作者后期也將進一步驗證。

綜上所述，本研究通過高通量技術對P.gingivalis感染的KYSE-30細胞中的外泌體進行測序，并對其差異表達的miRNA進行靶基因預測以及GO、KEGG富集分析，得到了一批差異表達的miRNAs及相關的信號通路。結果表明P.gingivalis可能通過影響食管癌外泌體miRNA的表達譜進一步調控相關的信號通路，參與食管癌的發生發展。