牙齦卟啉單胞菌在口腔—消化道腫瘤中的感染情況分析

孔金玉，原 翔，劉怡文，孫 蔚，谷變利，蘭子君，高社干

腫瘤的發生發展常伴隨一系列遺傳和表觀遺傳的改變，受飲食、環境和微生物暴露以及宿主免疫等的影響。自幽門螺桿菌與胃癌的因果關系確定以來[1]，不同種類的細菌感染及其相應的局部微生態的失衡與腫瘤發生發展的關系成為近年腫瘤研究的熱點之一。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis, Pg)是一種革蘭氏陰性厭氧菌，是牙周病變主要的優勢菌，是毒力最強的致病菌之一[2]。口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，且血供豐富，致病菌可以輕易地隨血液循環至全身。已有研究證實Pg與口腔癌、胰腺癌的發生發展相關[3-4]。本團隊前期研究顯示Pg與食管癌的發生發展有相互關聯性[5-6]。本研究旨在檢測Pg在口腔及消化道腫瘤中的感染情況，相關結果現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2018年12月河南科技大學第一附屬醫院手術切除的口腔及食管鱗癌組織標本各50例，賁門、胃癌各30例及結直腸癌35例。腫瘤標本取自原發灶，取出后一部分置于液氮迅速冷凍，-80 ℃冰箱凍存待用，一部分經甲醛固定，石蠟包埋。所有患者均經病理學確診為癌，且術前均未接受放化療及免疫治療，并于術前獲得患者書面知情同意。本項目經過醫院倫理委員會的同意。

1.2 主要試劑兔抗人Pg蛋白多克隆抗體獲贈于美國路易斯維爾大學實驗室，被用于檢測Pg感染；免疫組織化學SP超敏試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；檸檬酸抗原修復液(pH6.0)、蘇木精、中性樹膠購自索萊寶生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自諾唯贊公司；Pg上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG3’及Pg下游引物5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。

1.3 免疫組化癌組織經10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成3 μm厚石蠟切片。切片經0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液抗原高壓熱修復，采用免疫組織化學SP法，兔抗人Pg多克隆抗體濃度為1∶1 000，以0.01 mol·L-1的PBS(pH值7.5)代替一抗作為陰性對照，以組織中顯示棕黃色為Pg表達陽性。根據組織切片胞漿及胞核著色的強度和染色面積進行綜合評分，在組織切片中，隨機挑選4個高倍鏡視野觀察(200倍)，染色強度：0分，未著色；1分，呈淺黃色；2分，呈棕黃色；3分，呈棕褐色；染色面積：陽性細胞所占比例0%～5%，0分；6%～25%，1分；25%～75%，2分；>75%，3分；免疫組化評分計算方法：染色強度乘以染色面積得總分，1～12分分別代表：0分，-，陰性；1～3分，++，弱陽性；4～8分，++，中陽性；9～12分，+++，強陽性。為方便統計，將“-”定為陰性，“+” “++”和“+++”定為陽性。

1.4 qPCR取凍存的癌組織樣本100 mg在液氮中研磨至粉末狀，加1 mL Trizol并按說明書提取總RNA，Nano-Drop 2000c(Thermo公司)微量紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，1%瓊脂凝膠電泳鑒定RNA完整性，根據逆轉錄試劑盒說明書(Vazyme公司R222-01)，總反應體系為20 μL。逆轉錄反應條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。根據Q-PCR試劑盒說明書(Vazyme公司 Q111-02)，每個PCR反應體系為20 μL，每個樣本設3個復孔，用BIO-RAD熒光定量PCR儀進行定量檢測。反應條件：95 ℃變性 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(采集熒光)；40 個循環。

1.5 統計學處理用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，采用χ2檢驗分析免疫組化和qPCR兩種方法的一致性，以α=0.05為檢驗水準，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化法檢測Pg在口腔—消化道腫瘤組織中的感染情況應用免疫組化法分別檢測口腔、食管鱗癌各50例，賁門、胃癌各30例及結直腸癌35例組織中Pg的陽性率。結果發現Pg主要位于細胞質，陽性染色呈棕黃色顆粒，見圖1。Pg在口腔、食管鱗癌組織中的陽性率分別為60.00%(30/50)和46.00%(23/50)；在賁門、胃、結直腸癌組織中的陽性率分別為20.00% (6/30)、6.67%(2/30)、2.86%(1/35)，見表1。

A、C、E、G、I分別為Pg染色陽性的口腔鱗癌、食管鱗癌、賁門癌、胃癌、結直腸癌組織；B、D、F、H、J分別為Pg染色陰性的口腔鱗癌、食管鱗癌、賁門癌、胃癌、結直腸癌組織。圖1 Pg在口腔—消化道腫瘤中的感染情況(DAB，×400)

2.2 qPCR法檢測Pg在口腔—消化道腫瘤組織中的感染情況應用qPCR法分別檢測50例口腔鱗癌、50例食管鱗癌、30例賁門癌、30例胃癌及35例結直腸癌組織中Pg的陽性率。結果顯示Pg在口腔、食管鱗癌組織中的陽性率分別為56.00%(28/50)和42.00%(21/50)；Pg在賁門、胃、結直腸癌組織中的陽性率分別為16.67% (5/30)、3.33%(1/30)、2.86%(1/35)。Pg在口腔—消化道中的感染情況呈現上高下低的特點。

表1 Pg在口腔—消化道腫瘤中的感染情況 例(%)

2.3 兩種方法檢測Pg的一致性分析所有樣本應用χ2檢驗分析免疫組化和qPCR檢測Pg陽性率的一致性。結果顯示免疫組化與PCR法的結果具有一致性，一致率為91.8%，一致性系數Kappa為0.806，P<0.001，見表2。

表2 兩種方法檢測Pg的一致性分析

3 討論

Pg是寄居于口腔牙齦上皮細胞內的一種革蘭氏陰性厭氧菌，作為口腔中的“紅色復合體”三大致病菌之一[7]，Pg已被證實是整個口腔微生態平衡的關鍵細菌。口腔特殊的解剖結構與環境賦予Pg重要的病理生理學意義，廣泛的血源性侵入可促進Pg參與全身系統性疾病進程。新近研究發現，Pg可不間斷侵入感染大腦，破壞神經元，是阿爾茲海默癥的高危險因素[8]。近年來大量研究結果已表明，Pg抗體水平與冠狀動脈粥樣硬化、呼吸道感染及骨質疏松等系統性疾病臨床風險皆呈正相關[2,9-10]。更為嚴峻的是，作為介導長期慢性感染而致癌的重要致病菌之一，Pg已被證實為頭頸部鱗癌重要病因之一[11-12]。

本研究結果顯示，Pg定植于口腔鱗癌組織中，感染率為56.00%，目前國內外已有相關研究。2011年，Katz等[3]在一項分析報告中采用抗Pg (ATCC 33277)特異免疫組化法，比較了10例口腔鱗癌和5例健康受試者口腔組織樣本中Pg的表達，發現Pg在口腔鱗癌腫瘤組織中的表達遠高于正常組織，作者同時選擇共生細菌，鏈球菌戈登作為參照，而后者未表現出任何表達差異。盡管此次研究的樣本量較小，卻首次確切報道了Pg感染與口腔鱗癌發生的顯著正相關性。自此，許多研究開始探索Pg參與致癌作用的機制[13]，盡管如此，Pg在口腔鱗癌發病中的作用仍不清楚，其潛在的機制待進一步研究。

本研究發現Pg在食管鱗癌、賁門及胃癌中的感染率分別為42.00%、16.67%、3.33%，與本團隊之前研究報道一致[5]。本團隊2016年在國際上首次發現Pg是食管癌的高危因素[6]，2017年研究證實Pg在食管癌和癌前病變組織中廣泛定植，癌旁及正常黏膜組織中則豐度較低，在賁門和胃癌中的含量很低或沒有，這種差異被歸因于Pg對pH酸性環境的低耐受性[5]。Salazar等[14]2013年在一項包含37例慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生或不典型增生的牙周炎患者的臨床研究中，采用實時熒光定量PCR法在上述患者的牙菌斑和唾液樣本中檢測了包括Pg在內的幾種牙周致病菌的DNA表達水平。結果顯示，3種牙周致病菌，Pg、Td(Treponemadenticola)、Tf(Tannerellaforsythia)在牙菌斑中的定植，可增加胃癌癌前病變的發生風險。以上報道均提示Pg可能以某種方式參與了腫瘤的發生發展。

本研究同時發現，在結直腸癌組織中也存在Pg感染，感染率較低(2.86%)，目前國內外尚無相關報道。2013年，Wu等[15]發表的病例對照研究報告中，采用16S rRNA基因焦磷酸測序檢測了19例結腸癌患者及20例健康受試者糞便微生物的變化，發現卟啉單胞菌屬在結腸癌患者的糞便樣本中遠高于健康受試者。Hale等[16]的研究表明在結腸腺瘤患者糞便樣本中口腔菌屬的數量，包括放線菌屬、棒狀桿菌屬、嗜血桿菌屬、念珠菌屬和卟啉單胞菌屬明顯高于對照組。2017年，也有研究顯示在結直腸癌患者的糞便樣本中發現了更多的牙周病原體，如梭桿菌、顫螺旋菌屬、消化鏈球菌、卟啉單胞菌、羅斯氏菌和瘤胃球菌[17-18]。上述研究僅僅在結直腸癌患者的糞便中發現了卟啉單胞菌，并未在其癌組織中發現Pg，本研究首次發現結直腸癌組織中Pg的感染。

綜上所述，Pg在口腔癌中感染率最高，但在結直腸癌中感染率低至2.86%，提示Pg在口腔—消化道腫瘤中感染呈上高下低的分布規律，Pg可能通過口腔進入食管及賁門組織，又由于胃酸的原因，在胃及結腸中幾乎消失。這些數據表明，根除口腔致病菌可能有助于口腔及食管、賁門癌的防治。