EZH2蛋白在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義

武萍萍，梁志強(qiáng)，李仁哲，陶 然，馮 景

1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧 272000；2.廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東廣州 510005；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 210404

三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體2亞型(HER-2)表達(dá)均為陰性的乳腺癌類(lèi)型[1],占乳腺癌總數(shù)的10%～17%[2]，具有發(fā)病年齡小、腫瘤體積大、病理分級(jí)高、轉(zhuǎn)移時(shí)間早、生存率低等特征[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，表觀遺傳學(xué)改變發(fā)揮著重要作用。表觀遺傳學(xué)改變是一種可遺傳又不發(fā)生DNA序列變化的遺傳形式，其中DNA啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化是較為常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)改變。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶同源序列2增強(qiáng)子(EZH2)是PcG基因家族的重要成員之一,它是果蠅zeste基因增強(qiáng)子E(z)的人類(lèi)同源基因，可催化組蛋白H3的第27位氨基酸K27發(fā)生三甲基化(H3K27Me3)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，同時(shí)該基因表達(dá)產(chǎn)物可以使抑癌基因發(fā)生沉默，在多種腫瘤演進(jìn)過(guò)程中起重要作用[4-6]。本研究通過(guò)分析EZH2蛋白在TNBC中的表達(dá)情況及其與TNBC的臨床病理特征和腫瘤演進(jìn)的關(guān)系，探索EZH2成為早期診斷TNBC及預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后標(biāo)記物的可能性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年12月至2019年5月山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院和廣州金域檢驗(yàn)中心經(jīng)手術(shù)及病理學(xué)檢查證實(shí)為乳腺癌且資料齊全的患者222例,均為女性患者。其中非TNBC患者(非TNBC病例組)104例，年齡29～87歲，平均(51.9±12.6)歲；TNBC患者(TNBC病例組)118例，年齡31～89歲，平均(45.6±13.2)歲。另選取TNBC病例組中65例患者的癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照，65例患者年齡31～89歲，平均(49.2±12.5)歲。所有病例均按2012年世界衛(wèi)生組織(WHO)乳腺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分型。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色。試劑采用購(gòu)自Cell Signal公司的EZH2兔抗人單克隆抗體(1∶400)，使用DAKO ChemMate EnVision檢測(cè)系統(tǒng)及K500711檢測(cè)試劑盒。磷酸鹽緩沖液(PBS)的pH=7.2，Tris-乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液的pH=7.4，H2O2由Novocastra公司提供(3%)。PBS代替一抗作為空白對(duì)照，扁桃體淋巴細(xì)胞作為陰性對(duì)照，已確認(rèn)的乳腺癌樣本做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷 所有切片的免疫組織化學(xué)染色均由2位從事乳腺腫瘤病理診斷5年以上的醫(yī)生在同一條件下完成，要求顯微鏡下每個(gè)400倍視野至少有200個(gè)可用于評(píng)價(jià)的細(xì)胞，染色結(jié)果經(jīng)聯(lián)合閱片協(xié)商后給出。EZH2蛋白定位于細(xì)胞核，表達(dá)陽(yáng)性定義為觀測(cè)到突出于背景、大小不等的棕黃色顆粒。依據(jù)染色強(qiáng)度及該強(qiáng)度下陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。無(wú)染色記0分；弱染色定義為在40×物鏡視野才能看到細(xì)胞染色，記1分；強(qiáng)染色定義為在4×或10×物鏡視野能看到的細(xì)胞染色，記3分；中等染色介于強(qiáng)染色與弱染色之間，記2分。組織化學(xué)評(píng)分(HSCORE)=∑(I×PC)，其中I代表染色強(qiáng)度得分，PC代表在每個(gè)強(qiáng)度被染色細(xì)胞的比例。將HSCORE>30分定義為EZH2蛋白表達(dá)陽(yáng)性，并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用logistic回歸對(duì)EZH2陽(yáng)性表達(dá)的影響因素進(jìn)行多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EZH2蛋白在乳腺組織中的表達(dá) EZH2蛋白在非TNBC組織(圖A1、A2)陽(yáng)性表達(dá)率為79.8%，在TNBC組織(圖B1、B2)陽(yáng)性表達(dá)率為84.7%，在癌旁組織(圖C1、C2)陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%。TNBC組織與非TNBC組織EZH2蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNBC組織EZH2蛋白表達(dá)與非TNBC組織EZH2蛋白表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A1為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(非TNBC病例組)組織，A2為EZH2免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性，HSCORE為120分；B1為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(TNBC病例組)組織，B2為EZH2染色陽(yáng)性，HSCORE為180分；C1為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(TNBC病例組)癌旁組織，C2為EZH2染色陽(yáng)性，HSCORE為40分。

圖1 3種組織中EZH2蛋白的表達(dá)情況

2.2TNBC病例組組織中EZH2蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 TNBC病例組患者中,EZH2蛋白的表達(dá)與乳腺癌病理分級(jí)、乳腺癌直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與乳腺癌病理類(lèi)型、脈管神經(jīng)浸潤(rùn)、患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3TNBC中EZH2蛋白表達(dá)的多因素logistic回歸分析 組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑與EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)有相關(guān)性，且均為正相關(guān)(P<0.05),其中乳腺癌組織學(xué)分級(jí)與EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)性最高。見(jiàn)表2。

表1 TNBC病例組組織中EZH2蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

注：a其他包括乳腺腺樣囊腺癌1例，乳腺浸潤(rùn)性微乳頭狀癌1例，黏液癌3例，乳腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，乳腺高級(jí)別導(dǎo)管原位癌1例。

表2 TNBC病例組組織中EZH2蛋白表達(dá)的多因素logistic回歸分析

3 討 論

EZH2是果蠅zeste基因增強(qiáng)子E(z)的人類(lèi)同源基因，定位于染色體7q35上，是PcG基因家族的重要成員[7]。作為PRC2蛋白復(fù)合體的核心組分，EZH2與SUZ12和EED共同組成多梳抑制型復(fù)合體。該復(fù)合體發(fā)揮組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，催化組蛋白的甲基化修飾，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化在DNA甲基化的建立和維護(hù)中發(fā)揮重要作用[8-9]。另外，EZH2可以通過(guò)改變核小體、重塑染色質(zhì)，以及與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在胚胎的發(fā)育、細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，EZH2基因及其表達(dá)產(chǎn)物與腫瘤的演進(jìn)、侵襲和轉(zhuǎn)移有較高的相關(guān)性[11]，其在消化道腫瘤、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌等腫瘤中的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照人群[12-16]。

與其他系統(tǒng)腫瘤相同，乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移是多基因表達(dá)調(diào)控失衡的共同結(jié)果，其中DNA甲基化與乳腺癌的關(guān)系最為密切。研究DNA甲基化對(duì)探索乳腺癌的病因及乳腺癌的診療具有重要的臨床意義[17]。與胡一迪等[3]的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)一致，本研究中TNBC病例組患者年齡顯著小于非TNBC病例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EZH2和乳腺癌增殖和侵襲能力有重要關(guān)系。KLEER等[18]通過(guò)對(duì)乳腺癌動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，EZH2過(guò)表達(dá)時(shí)乳腺細(xì)胞能夠產(chǎn)生致瘤性。GONZALEZ等[19]發(fā)現(xiàn)，EZH2過(guò)表達(dá)可以造成乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生異常的有絲分裂及基因組不穩(wěn)定，敲除EZH2基因，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。DIMRI等[20]發(fā)現(xiàn)，EZH2表達(dá)水平降低可以導(dǎo)致EZH2參與抑制的E鈣黏蛋白和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白重新表達(dá)，從而降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，TNBC和非TNBC組織中EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TNBC與非TNBC組織中EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與姚凡等[21]的研究不一致，其研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在TNBC組織中表達(dá)顯著高于非TNBC組織，分析原因可能與本研究入組的TNBC病例組病例數(shù)明顯高于非TNBC病例組有關(guān)。另外，乳腺癌本身具有高度異質(zhì)性，也可能造成結(jié)果判讀的不同。本研究還發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著高于EZH2蛋白表達(dá)陰性組，與AZIZMOHAMMADI等[22]在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的結(jié)果相近。BACHMANN等[23]認(rèn)為，EZH2表達(dá)量的異常升高與乳腺癌侵襲性和增殖能力存在密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的TNBC，其組織學(xué)級(jí)別顯著高于EZH2蛋白表達(dá)陰性者，腫瘤體積顯著大于EZH2蛋白表達(dá)陰性者。另外，WANG等[24]研究乳腺癌和鼠胚胎干細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌侵襲性表型是EZH2與BRCA1相互影響抑制胚胎干細(xì)胞分化產(chǎn)生的。CHIEN等[1]發(fā)現(xiàn)，EZH2通過(guò)影響TIMP2-MMP-2/-9通路可以造成乳腺癌增殖能力的改變，對(duì)此本研究并沒(méi)有深入分析。logistic回歸分析結(jié)果顯示，EZH2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率越高，提示TNBC病理分級(jí)會(huì)越高，腫瘤直徑就越大，患者預(yù)后就越差,對(duì)于這類(lèi)患者臨床診治過(guò)程中更需要加以重視。

本研究上有一些不足之處，入組的病例數(shù)特別是癌旁組織的例數(shù)需要進(jìn)一步增加，以期獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。另外，沒(méi)有增加同一病理學(xué)類(lèi)型的TNBC和非TNBC組織EZH2表達(dá)情況的對(duì)比分析。

總之，盡管EZH2能否作為早期診斷TNBC的標(biāo)志物尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探索，但是EZH2蛋白與TNBC病理學(xué)行為有一定相關(guān)性，可能有助于早期預(yù)測(cè)TNBC患者的預(yù)后，并在TNBC患者臨床治療方案的合理選擇中具有重要參考意義。