LINC00176下調miR-761對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

宋志韜 鄭丹 陳志濤 甘洪穎 吳凡 周婷婷 張姮

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院消化內科，湖北 武漢 430014)

胃癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤〔1〕，晚期胃癌的治療方式是以全身化療為主的綜合治療，盡管化療能夠延長腫瘤患者的生存期，但副作用較明顯〔2〕。而針對腫瘤特定靶點的小分子靶向藥物因其不良反應較輕、耐藥率低等優點受到關注，腫瘤進展中的相關信號通路及異常表達的相關基因均可作為潛在的作用靶點〔3〕。研究發現長鏈非編碼RNA(lncRNA)在胃癌的發生發展中發揮重要作用，影響胃癌細胞的增殖、凋亡、轉移和預后等〔4〕。微小RNAs(miRNAs)是一種非編碼RNAs，調控與胃癌進程密切相關的基因表達水平，影響胃癌的發生發展〔5〕。lncRNA可以結合miRNA參與調控胃癌進程，了解miRNA及lncRNA在胃癌中的具體作用機制，可以為胃癌的診治提供新思路〔6〕。本文旨在研究lncRNA LINC00176與miR-761的調控關系及其對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細胞MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細胞GES-1購自上海冠導生物工程有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自上海圻明生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自上海伯易生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學發光法(ECL)發光液、RIPA蛋白裂解液購自北京凱瑞基生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海北諾生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室、基質膠購于美國BD公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2細胞培養 RPMI-1640培養基添加10%胎牛血清，將胃癌細胞MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細胞GES-1置于上述培養液中，然后置于37℃、含5% CO2的培養箱中培養，每天換一次新鮮培養液，待細胞融和至70%左右時，加入0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3細胞轉染與分組 對數生長期細胞SGC-7901用無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。轉染分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-761組(轉染miR-761 mimics)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-LINC00176組(轉染pcDNA3.1-LINC00176)、si-NC組(轉染si-NC)、si-LINC00176組(轉染si-LINC00176)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-761組(轉染anti-miR-761)、miR-NC+WT-LINC00176組(共轉染miR-NC和WT-LINC00176)、miR-NC+MUT-LINC00176組(共轉染miR-NC和MUT-LINC00176)、miR-761+LINC00176組(共轉染miR-761和WT-LINC00176)、miR-761+MUT-LINC00176組(共轉染miR-761和MUT-LINC00176)、pcDNA3.1-LINC00176+anti-miR-NC組(共轉染pcDNA3.1-LINC00176和anti-miR-NC)、pcDNA3.1-LINC00176+ anti-miR-761組(共轉染pcDNA3.1-LINC00176和anti-miR-761)，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.4MTT檢測細胞增殖 取培養24、48、72 h時間點的各組細胞，然后每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩充分反應10 min后用酶標儀檢測波長為490 nm的各孔吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲 對數生長期細胞調整濃度為2×104個/ml。細胞遷移實驗：分別在Transwell小室的上室和下室計入200 μl細胞懸液和500 μl培養液，37℃培養24 h，然后用4%多聚甲醛固定，再用0.1%結晶紫染色，顯微鏡觀察遷移細胞數并拍照。細胞侵襲實驗：基質膠用6倍體積的RPMI1640培養液稀釋后，添加在Transwell小室的上室，凝固后，按照細胞遷移實驗步驟操作。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組培養48 h的細胞，漂洗后先后加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，然后上機檢測。實驗重復3次。

1.7qRT-PCR檢測miR-761和LINC00176表達 各組培養48 h的細胞提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進行操作，循環條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環；最后60℃再延伸5 min。以β-actin為內參進行PCR擴增，相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.8Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、Bcl-2、Bax、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、E-鈣黏蛋白(cadherin)蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后轉至PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，顯影、定影、成像，測定蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白相對表達水平。

1.9熒光素酶報告基因實驗檢測LINC00176和miR-761的靶向關系 使用PCR擴增包含miR-761結合位點的LINC00176序列片段，并構建至熒光素酶表達載體中，獲得LINC00176野生型載體(WT-LINC00176)，將LINC00176序列 CAACCTGCTG突變為CAAAGCACTG，獲得LINC00176突變型載體(MUT-LINC00176)，將WT-LINC00176、MUT-LINC00176分別與miR-NC、miR-761共轉染至SGC-7901細胞中，轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.10統計學分析 采用SPSS20.0軟件t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1LINC00176在胃癌細胞和正常胃黏膜細胞中的表達 與正常胃黏膜細胞GES-1(1.33±0.12)相比，胃癌細胞MGC-803、SGC-7901中LINC00176的表達水平(0.67±0.04、0.35±0.02)顯著降低(F=137.049，P=0.000)。

2.2過表達LINC00176對胃癌細胞增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細胞的抑制率顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達顯著降低，P21、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

2.3過表達LINC00176對胃癌細胞遷移、侵襲的影響 pcDNA3.1-LINC00176組LINC00176水平(0.82±0.06)顯著高于pcDNA3.1組(0.36±0.03，t=11.877,P=0.000)。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組MPP-2蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00176組胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見圖3，圖4，表2。

圖1 過表達LINC00176對細胞SGC-7901凋亡的影響

圖2 過表達LINC00176對細胞SGC-7901增殖、凋亡蛋白表達的影響

表1 過表達miR-761對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡的作用

與pcDNA3.1組比較:1)P<0.05；與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組比較:2)P<0.05；同表2

圖3 過表達LINC00176對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的影響(×200)

圖4 過表達LINC00176對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.4LINC00176靶向、調控miR-761 TargetScan數據庫預測顯示LINC00176與miR-761部分序列有結合位點(圖5)。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，相較于miR-NC組(1.03±0.08)，miR-761組轉染WT-LINC00176細胞的熒光素酶活性(0.22±0.02)顯著降低(t=55.029，P=0.000)；而轉染MUT-LINC00176細胞的熒光素酶活性(1.01±0.09 vs 0.99±0.10)差異無統計學意義(t=0.364,P=0.723)。相較于pcDNA3.1組(0.77±0.06)，pcDNA3.1-LINC00176組miR-761表達水平(0.16±0.01)顯著降低；相較于si-NC組(0.74±0.06)，si-LINC00176組miR-761表達水平(1.23±0.11)顯著升高(P<0.05)。

表2 過表達miR-761對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的作用

2.5抑制miR-761表達對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組CyclinD1、Bcl-2、MPP-2蛋白表達水平顯著降低，P21、Bax、E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組胃癌SGC-7901細胞抑制率顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組胃癌SGC-7901細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-761組胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見表3，圖6。

圖5 LINC00176靶向miR-761

表3 抑制miR-761表達對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

圖6 抑制miR-761表達對細胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.6過表達miR-761能逆轉LINC00176對胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 Western印跡檢測結果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組胃癌SGC-7901細胞中Cyclin D1、Bcl-2、MPP-2蛋白表達水平顯著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176 +miR-761組胃癌SGC-7901細胞抑制率顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組胃癌SGC-7901細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，與pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組相比，pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲數量顯著升高(P<0.05)。見表1，表2，圖7。

1～4：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-LINC00176組、pcDNA3.1-LINC00176+miR-NC組、pcDNA3.1-LINC00176+miR-761組圖7 增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白的表達

3 討 論

胃癌發病率及死亡率在我國均居第二位，嚴重威脅人民生命健康〔7〕。研究發現胃癌的進展涉及一系列分子水平的變化，因此分子水平上的靶向治療成為腫瘤治療新的研究方向〔8〕。lncRNA是腫瘤生物學的重要組成部分，可用于胃癌的早期診斷，具有高靈敏度、高特異度等優點〔9〕。有研究通過生物信息學方法，篩選得到胃癌組織中差異表達的lncRNA，證明LINC00176在胃癌組織中下調表達〔10〕。Ddh等〔11〕發現LINC00176在肝細胞癌中高表達，LINC00176缺失通過釋放腫瘤抑制miRNA破壞細胞周期并誘導肝細胞癌中的壞死性凋亡。食管癌中篩選的lncRNA中LINC00176在Cox回歸分析中是負系數，說明其是保護性lncRNA，lncRNA高表達比低表達的患者總體存活期更長〔12〕。本研究結果顯示，LINC00176在胃癌細胞中下調表達，過表達LINC00176可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡；且LINC00176靶向調控miR-761的表達。

研究表明miRNA參與胃癌發生、發展等過程，可作為胃癌診斷的生物標志物及治療的潛在靶標〔13〕。研究報道miR-761通過靶向下調CRKL抑制了卵巢癌SKOV3細胞增殖〔14〕；miR-761在乳腺癌中高表達，通過靶向抑制TRIM29促進乳腺癌生長和轉移〔15,16〕。miR-761在肝癌組織中高表達，通過抑制MFN2損傷線粒體功能且抑制肝癌細胞的生長和侵襲〔17〕。miR-761在非小細胞肺癌中顯著上調表達，通過靶向ING4和TIMP2促進非小細胞肺癌的進展和轉移〔18〕。而miR-761在結直腸癌中下調，過表達miR-761抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲，增加對5-氟尿嘧啶的敏感性〔19〕。Hsa-circ-0007534可以通過調節miR-761調節膠質瘤細胞的增殖和遷移〔20〕。miR-761在胃癌組織和細胞中上調表達，miR-761過表達促進胃癌細胞增殖、細胞集落形成，miR-761可能是胃癌患者新的治療靶位點〔21〕。本研究結果顯示，抑制表達miR-761可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡；過表達miR-761能逆轉LINC00176對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡的促進作用。

綜上，lncRNA LINC00176可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡，其機制可能與靶向miR-761基因有關，將可為胃癌的預防和治療提供新靶點和新思路。