褪黑素基于JAK-STAT通路對MPP+誘導的PC12細胞炎性損傷的影響

馬一聞 陳超 畢素貞 莊文欣 付文玉 呂娥

(濰坊醫學院 1生物科學與技術學院，山東 濰坊 261053；2醫學研究實驗中心；3組織學與胚胎學教研室)

帕金森病(PD)是廣泛存在于中老年群體的神經退行性疾病，PD的確切發病機制是醫學界的一大難題，目前已經確定PD的病理癥狀以不能運動，休息震顫和多巴胺(DA)能神經元的喪失為特征〔1〕。已有大量研究表明由膠質細胞激活觸發的神經炎癥在PD的發病機制中起著重要作用。活化的細胞產生促炎因子等炎癥介質，又反向刺激于這些細胞來表達炎性因子〔2〕。Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)途徑普遍存在由干擾素和細胞因子激活的信號轉導，在免疫應答的起始和調節中起關鍵作用。JAK/STAT途徑的異常激活在諸如PD和多發性硬化的神經炎癥疾病中非常明顯〔3〕。白細胞介素(IL)-6是JAK/STAT途徑中最有效的激活劑之一，PD中明顯升高，且與PD的患病風險密切相關〔4〕。

褪黑素(MT)是一內源性神經激素，且具有多靶點生物活性的小分子物質〔5〕。本課題組發現，MT對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)所致的PD小鼠模型上有較好的抗炎效果，而MT抑制神經炎癥反應的機制不明。結合JAK-STATs信號通路的特性和MT多靶點治療研究進展，本研究擬采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶脫氫物(MPP+)損傷PC12細胞的PD模型，探討 MT的抗神經炎癥作用及利用JAK/STAT通路改善神經炎癥的可能性，從而為MT防治神經退行性疾病的研究提供可靠的理論基礎。

1 材料和方法

1.1細胞、試劑和儀器 小鼠嗜鉻細胞瘤(PC)12細胞(上海中國科學院細胞庫)；MT、MPP+、細胞裂解液(RIPA)(均Sigma公司)；胎牛血清和RPMI-1640(均HyClone公司)；細胞毒性/增殖檢測試劑盒CCK-8(YEASEN公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；兔抗多克隆抗體磷酸化的(p)-STAT1、p-STAT3、STAT1、STAT3(均Immunoway公司)；兔抗多克隆抗體IL-17A、IL-1β和IL-6(均Bioss公司)；化學發光液(Thermo 公司)。Multiskan FC型酶標儀(Thermo Fisher公司)；Western印跡高電流電泳儀(BIO-RAD公司)；化學發光凝膠成像系統(愛博科技貿易公司)。

1.2細胞分組及處理 細胞培養基為10%胎牛血清加1%青鏈霉素混合液(青鏈霉素濃度均為100 μg/ml)，培養于5% CO2、37℃恒溫培養箱中。傳至4代后，胰蛋白酶消化(0.25%)處于對數期且狀態良好的細胞，并制成細胞懸液調配到適宜濃度后接種于孔板中，并分為如下四組：對照組；模型組：200 μmol/L的MPP+干預36 h(預實驗中檢測不同濃度MPP+的損傷效果，其中200 μmol/L最佳)；治療組：200 μmol/L的MPP+處理12 h后，再加入800 μmol/L的MT處理24 h(預實驗中采用不同藥物濃度進行篩選，發現800 μmol/L MT修復效果最佳，后續實驗采用此濃度給予干預)；MT組：加入800 μmol/L的MT處理24 h(與治療組加入MT的時間相同)。

1.3顯微鏡觀察細胞形態 將各組細胞混懸液滴加到6孔板中，接種各孔劑量1 ml濃度為3×105個/ml，12 h后將細胞分組及藥物干預，每隔12 h觀察細胞并拍照。

1.4CCK-8法檢測細胞活性 將制好的細胞混懸液以4×103個/ml濃度每孔100 μl的劑量滴加到96孔板中，細胞分組并給予MPP+及MT干預，吸去原有培養基，加入CCK-8培養基混合液100 μl并置于培養箱中培養3 h后，酶標儀檢測各孔450 nm的吸光度值。

1.5免疫細胞化學法檢測IL-1β、IL-6的含量 將PC12細胞濃度為1×105個/ml的懸液以400 μl每孔的劑量滴加到24孔板中進行爬片，培養12 h后分組并加藥干預。吸除各孔中培養基，依照劉金城等〔6〕方法步驟進行細胞處理和后續細胞免疫組織化學流程，一抗為兔抗IL-1β(1∶200)、IL-6(1∶200)抗體(30 μl/孔)，結果采用Image Pro Plus5.1軟件進行平均光密度值(MOD)分析。

1.6Western印跡法檢測IL-17A、IL-6、p-STAT1、p-STAT3、STAT1和STAT3的蛋白表達 將3×105個/ml PC12細胞懸液接種至6孔板中每孔1 ml，細胞分組給予藥物，蛋白提取、濃度檢測、Western印跡的詳細步驟及顯影參照劉飛等〔7〕的實驗方法，實驗中滴加一抗，分別為兔抗多克隆抗體IL-17A(1∶1 500)、IL-6(1∶1 500)、p-STAT1(1∶800)、p-STAT3(1∶800)、STAT1(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH(1∶1 000)抗體。實驗結果采用Image J軟件分析各組條帶的吸光度(AA)，目的蛋白AA與GAPDH蛋白AA比值表示各目的蛋白的相對表達值。

1.7統計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1MT可修復MPP+對PC12細胞的損傷 對照組細胞分布均勻，胞體發出不規則突起；模型組漂浮細胞大量出現，細胞內有空泡，細胞出現聚集，折光性升高，胞體萎縮變圓顏色發暗；而給予MT后，治療組細胞狀態有所好轉，貼壁細胞數量增多，聚集現象及萎縮的胞體較少，細胞折光性降低；MT組細胞分布狀態、外形結構、生長狀態及后續各項檢測與對照組相比，均無顯著性差異。見圖1。

2.2MT可阻止MPP+導致的 PC12細胞活力的下降 與對照組(0.66±0.04)相比，模型組細胞活力(0.40±0.07)明顯變弱；與模型組比較，給予MT后治療組細胞活力明顯好轉(0.58±0.09，P<0.05)，MT組細胞活力(0.69±0.04)與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3MT可降低MPP+誘導的PC12細胞的神經炎癥反應 與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表達顯著增加(P<0.05)，與模型組比較，治療組IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表達明顯減少(P<0.05)。MT組IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表達與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖2。對照組細胞形態良好，染色較淡；而模型組部分細胞內存在空泡，且存在聚集現象，陽性細胞染色加深；與模型組比較，治療組細胞狀態較好，細胞空泡較少，染色變淡。見圖3。

2.4MT可抑制MPP+誘導的PC12細胞的JAK-STATs信號通路的激活 與對照組比較，模型組p-STAT1、p-STAT3表達均明顯增高(均P<0.05)，與模型組比較，治療組p-STAT1、p-STAT3明顯降低(均P<0.05)。各組STAT1、STAT3無明顯變化。MT組各指標與對照組均無統計學差異(P>0.05)。見圖4、表2。

表1 各組PC12細胞IL-1β和IL-6MOD、IL-17A和IL-6蛋白表達

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖2 IL-17A和IL-6蛋白在各組PC12細胞的相對表達

圖3 IL-1β和IL-6在各組PC12細胞中的表達(DAB，×200)

圖4 p-STST1、STAT1、p-STAT3和STAT3蛋白在各組PC12細胞的相對表達

表2 各組PC12細胞p-STST1、STAT1、p-STAT3和STAT3蛋白表達相對值

3 討 論

全基因組關聯研究表明，強調了中樞神經系統疾病(包括PD)的發病機制或調節與免疫系統基因的關聯，認為神經炎癥反應和促炎介質釋放的調節可能會影響癥狀和嚴重程度〔8〕。臨床研究發現伴有震顫的PD患者在腦脊液和血清中IL-6水平 顯著增強〔9〕。本實驗發現，在給予MPP+處理后，細胞狀態呈現顯著惡化，細胞活力明顯降低，促炎因子IL-17A、IL-1β和IL-6表達顯著上升。

先天性免疫反應在神經炎癥中具有致病和保護作用，這取決于疾病的發病機制和中樞神經系統所處的微環境，小膠質細胞、T細胞等是參與監測該微環境的主要細胞〔10〕，而JAK/STAT途徑的激活可加重致病性神經炎癥的進展。Zhu等〔11〕用特異性JAK抑制劑預處理可減少STAT3的磷酸化并阻斷抗炎因子IL-10介導的針對脂多糖(LPS)損傷的腹側中腦原代神經元的保護作用。用聚集的α-突觸核蛋白(SYN)刺激小膠質細胞系或原代小膠質細胞可導致主要組織相容性復合因子(MHC)Ⅱ類的表達和一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β產生，通過JAK1/2抑制劑AZD1480可抑制JAK/STAT途徑的激活〔12〕。Przanowski等〔13〕在LPS導致的模型上發現，p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5可誘發產生促炎因子。本研究發現給予MPP+可誘發PC12細胞p-STAT1、p-STAT3表達上升。

MT是由松果體分泌的一種具有睡眠調節、增強免疫、抗癌活性、抗炎抗氧化特性和神經保護等強大功能的吲哚類激素〔14〕，可通過質膜上的特定細胞受體或其他非受體依賴性途徑發揮其作用。MT可調節自身免疫性脊髓炎小鼠模型的少突膠質細胞的功能，減少促炎因子(IL-1β和TNF-α)和增加抗炎因子(IL-4和IL-10)來減輕炎癥，降低神經功能障礙評分并增強髓鞘再生〔15〕。MT對6-羥基多胺(OHDA)誘導的偏側PD大鼠模型具有抗氧化和神經保護作用〔16〕，可對表達PD相關表型基因parkin/PINK1/DJ-1/MUL1的斑馬魚胚胎發揮挽救作用〔17〕。本實驗發現，MT可有效減輕MPP+誘導PC12細胞所產生的炎癥反應并抑制p-STAT1和p-STAT3表達。

綜上，MT可降低MPP+誘導的炎癥反應，并通過進一步探討發現MT可抑制JAK-STATs信號通路中p-STAT1和p-STAT3表達來降低IL-1β、IL-6、IL-17A等促炎因子的表達，進而參與神經保護作用，為MT在PD的臨床治療提供了可靠的實驗和理論依據。