抑制MMP-9表達與大鼠氧糖剝奪后星形膠質細胞AQP4的表達變化

李燕華 韋俊杰 周禮圓 范秉林 陳志 韋旋 歐陽列鋒

(廣西壯族自治區人民醫院神經內科，廣西 南寧 530021)

在腦缺血早期，基質金屬蛋白酶(MMP)-9的表達及其活性會受到血流動力學改變、損傷、炎癥及氧化應激等因素影響而升高〔1〕，升高后MMP-9與腦缺血和腦水腫的發展呈平行關系〔2〕。水通道蛋白(AQP)4在星形膠質細胞上表達最為豐富,在腦組織水的運輸和調節中起關鍵作用〔3〕，AQP4表達上調可能是腦水腫形成的一個重要致病環節。MMP-9的過度表達和激活在心血管疾病的病理生理過程中起重要作用〔4〕，但其在缺血性腦血管病繼發性腦水腫中的機制尚不清楚。本研究旨在觀察抑制MMP-9表達及氧糖剝奪后星形膠質細胞AQP4表達的變化。

1 材料和方法

1.1實驗動物和主要試劑 2 d 新生SD大鼠(廣西醫科大學實驗動物中心提供)。小牛血清、DMEM(Hyclone公司)，兔抗AQP4抗體(Abcam公司)，兔抗MMP-9抗體購自Proteintech公司，相應的二抗和鼠抗GAPDH抗體購自Santa Cruz公司。MMP-9、AQP4和β-actin的RT-PCR引物合成由上海吉凱生物公司提供。

1.2星形膠質細胞培養 取2 d新生SD大鼠，75%酒精浸泡消毒后，斷頭取皮層組織，入冰冷D-hanks液中仔細剝除軟腦膜和皮層血管，反復輕柔吹打制成細胞懸液，過濾，收集濾液，然后轉入70 ml培養瓶中，37℃、5% CO2培養箱中靜置培養，細胞培養1 w左右進行缺糖缺氧處理。取傳代2次的細胞進行星形膠質細胞特異性蛋白神經腦質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學染色，證實為星形膠質細胞。本實驗均使用培養第2代的星形膠質細胞。

1.3缺血細胞模型的制備 將細胞培養板置于特制有機玻璃通氣槽內，加入無糖培養基，持續通入不含氧的混合氣體(5%CO2+95%N2)來模擬缺糖缺氧環境，密封，置于37℃溫箱內，并調節氣流量的流速，要求氣體流速為5 L/min。經缺糖缺氧處理至少12 h后，可轉移到正常氧濃度和含糖培養基條件下繼續培養2 h，模擬細胞缺血損傷的病理生理學過程。

1.4慢病毒轉染 星形膠質細胞及實驗分組按照上海吉凱生物公司的慢病毒手冊，按照不同的復感染指數(MOI)，在星形膠質細胞培養第2天時，進行慢病毒轉染，24 h后，更換為完全培養基培養，培養72 h 后，通過倒置熒光顯微鏡來觀察細胞內綠色熒光蛋白(GFP)的表達。實驗分為3組，正常組不制成缺血細胞模型；陰性對照組：加入陰性對照siRNA后，再制成缺血細胞模型；MMP-9抑制組：經慢病毒轉染細胞后，再制成缺血細胞模型。

1.5四甲基偶氮唑藍(MTT)比色測定法檢測細胞活力 分別取各組細胞，每組孔數為6孔，每孔加入15 μl/ml MTT(5 mg/ml)置于37℃ 5 % CO2培養箱孵育4 h后，吸出孔內液體，然后加150 μl二甲基亞砜至MTT反應結晶產物完全溶解，在全自動酶標儀上，測定波長為570 nm，檢測每孔光密度(OD)值。

1.6免疫印跡法檢測AQP4蛋白表達 收集各組細胞，細胞加入組織裂解液后離心提取總蛋白，采用Bradford法蛋白定量，在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠每個點樣孔中加入5 μg蛋白進行電泳，待確定片段大小后，免疫印跡轉染到聚偏二氟乙烯膜，加封閉液室溫封閉1 h，繼之用目的蛋白AQP4和GAPDH的一抗4℃過夜孵育，再用結合辣根過氧化物酶的二抗孵育。化學發光法顯現蛋白帶并照相，用 Lab4.3對條帶進行密度分析。

1.7實時熒光定量RT-PCR法檢測MMP-9和AQP4 mRNA表達 直接提取細胞RNA，將適量RNA進行逆轉錄成cDNA，根據以往研究〔5〕方法，MMP-9上游引物序列：5′-GTCCAGACCAAGGGTACAG-3′，下游引物序列：5′-TTAGAGCCACGACCATACAG-3′，擴增片段為：181 bp；AQP4上游引物序列：5′-GAGGCGGTGGGGTAAGTGT-3′，下游引物序列：5′-TCCAAAGCAGAGGGAGATG-3′，擴增片段為214 bp；β-actin上游引物序列：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴增片段114 bp。用SYBR green熒光定量檢測法進行實時熒光定量PCR檢測mRNA表達。

1.8統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行SNK-q檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1MTT法檢測細胞活性 細胞經氧糖剝奪和慢病毒轉染MMP-9處理后，正常組OD值為 0.25±0.01，陰性對照組為 0.16±0.001，MMP-9抑制組為0.15±0.003，MMP-9抑制組和陰性對照組OD值明顯低于正常組(P<0.01)；MMP-9抑制組與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2各組MMP-9表達水平比較 陰性對照組和MMP-9抑制組轉染后72 h，和陰性對照組(1.105±0.236)相比，MMP-9抑制組MMP-9 mRNA表達水平(0.515±0.197)明顯下降(P<0.05)，MMP-9抑制組與正常組(0.352±0.086)相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組AQP4 mRNA表達 與陰性對照組(1.122±0.175)比較，MMP-9抑制組AQP4 mRNA(0.702±0.082)顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；MMP-9抑制組與正常組(0.585±0.046)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組AQP4 蛋白表達比較 正常組細胞AQP4蛋白表達灰度值為0.655±0.086，陰性對照組為1.007±0.175，MMP-9抑制組為0.745±0.107，MMP-9抑制組明顯低于陰性對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 免疫印跡檢測各組細胞AQP4蛋白表達

3 討 論

星形膠質細胞是中樞神經系統內數量最多和分布廣泛的細胞群體，也是中樞神經系統的主要膠質細胞，在神經系統的修復和再生、物質代謝和神經病理過程中具有重要作用。已有研究顯示，無論是細胞毒性腦水腫還是血管源性腦水腫，星形膠質細胞均是腦創傷和腦缺血后腫脹細胞的主要類型，其腫脹均發生在腦水腫的早期，為腦水腫發展過程中的一個重要表現。星形膠質細胞腫脹及隨后的應激反應可能是腦損傷后主要的早期病理現象〔3〕。腦缺血時星形膠質細胞可通過調節細胞外環境、產生和釋放生長因子，提供代謝底物支持神經元的存活，同時參與炎癥反應加重腦水腫的形成。腦細胞的水轉運主要通過AQP來完成，其中AQP4是腦內表達最豐富、轉運效率最高、主要表達于星形膠質細胞的AQP〔3，5〕。已有研究顯示，AQP4作為介導水分子運輸的主要調節因子，其表達上調可能是腦水腫形成的一個關鍵致病因素，已證實對中樞神經系統的代謝和大腦水平衡的調節起至關重要的作用〔6〕。目前主要觀點認為，腦缺血早期AQP4的增多會導致水入量增多，加重腦水腫形成，而后期的AQP4則促進細胞內過多水的流出〔7〕，在腦缺血早期短暫抑制AQP4的升高能減輕腦水腫的形成〔4〕。已有研究發現，MMP-9的過度表達和激活在心血管疾病的病理生理過程中起重要作用〔4〕，但在缺血性腦水腫中的作用機制尚不清楚。腦缺血后損傷主要表現為缺氧和缺糖，腦細胞損害的本質主要是腦組織氧、糖缺乏而導致的結果，大多患者主要選擇性去除具有至關重要作用的葡萄糖和氧以代表缺血所致的低營養條件。目前氧糖剝離是一種公認的離體缺血缺氧模型，因此本研究采用體外缺氧缺糖處理模擬星形膠質細胞的缺血性損傷，觀察細胞在缺血缺氧早期抑制MMP-9表達對氧糖剝奪后星形膠質細胞AQP4表達的影響，以期為臨床急性腦缺血的早期干預治療提供理論基礎。細胞培養使腦細胞基本保持了體內生長、發育和分化過程中的理化特點，且能在較長時間內直接觀察細胞在生長和分化過程中形態及功能的改變，也可方便使用各種方法進行研究，而且不受體內多種因素的影響。MTT檢測法能比較客觀地反映細胞的活性，活細胞線粒體內琥珀酸脫氫酶活性決定OD值的大小，能間接反映活細胞的數目，OD值越大，活細胞越多。本研究結果提示，細胞在氧糖剝奪后，不僅不能良好生存，而且星形膠質細胞受損必然會影響神經系統其他細胞的正常功能和內環境的穩定。缺血性腦水腫是導致腦缺血嚴重并發癥甚至死亡的關鍵病理因素，目前其發生和發展的分子機制尚未闡明〔8〕。本研究結果表明，抑制細胞MMP-9的表達在轉錄和翻譯水平均可誘導AQP4表達下調，進而參與影響腦水腫的進展，提示在腦缺血的早期，MMP-9可能通過調節星形膠質細胞AQP4的表達水平來參與缺血性腦水腫的病理生理過程，該作用可發生于基因轉錄和蛋白水平。

綜上，星形膠質細胞缺氧缺糖損傷后，抑制MMP-9表達可介導AQP4表達下調，提示MMP-9和AQP4可能共同參與缺血性腦水腫的形成。