井穴放血對大鼠腦梗死缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用

高靚 潘玥 趙貴捷 徐夢瑤 孟雪

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸臨床部 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué))

缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制多樣，現(xiàn)有的研究雖然已經(jīng)在缺血性腦卒中病理機(jī)制方面取得進(jìn)步，但基礎(chǔ)研究成果依然無法向臨床轉(zhuǎn)化，現(xiàn)臨床使用的神經(jīng)保護(hù)藥也只是清除氧自由基，治療效果不佳〔1,2〕。使用重組組織型纖溶蛋白酶激活劑靜脈溶栓是腦梗死主要治療手段，但該治療有嚴(yán)格的時(shí)間窗，存在較高的致命性出血風(fēng)險(xiǎn)，限制應(yīng)用〔3〕。因此根究缺血性腦梗死具體病理機(jī)制，探討一種新型的、合理的、有效的腦梗死治療手段，對挽救缺血半暗帶意義重大。針刺在我國已有多年的應(yīng)用歷史，研究發(fā)現(xiàn)，針刺用于缺血性腦卒中的治療能夠促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)功能的重塑與修復(fù)，這可能與針刺對腦出血再灌注損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活作用有關(guān)〔4〕。但現(xiàn)有的研究多集中于針刺對缺血性腦卒中恢復(fù)期的影響，在急性期的使用價(jià)值尚未見較多報(bào)道。刺絡(luò)放血療法是針刺的一種方式，井穴放血治療能夠提高大鼠缺血區(qū)腦組織抗應(yīng)激能力，有一定的腦保護(hù)作用〔5〕。本研究觀察井穴放血對大鼠腦梗死缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購入清潔、健康的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠90只，周齡均為8 w，體重0.24～0.26 kg；平均(0.25±0.01)kg。術(shù)前將大鼠置于安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)，5只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)，喂養(yǎng)飼料為全價(jià)顆粒，大鼠均在12 h的光照與黑暗周期內(nèi)自由進(jìn)食飲水。

1.2試劑 北京生物技術(shù)公司提供的水合氯醛，上海化學(xué)試劑公司提供的多聚甲醛、枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、3%過氧化氫、過硫酸銨，美國Sigma公司提供的顯色液、一抗稀釋液，石家莊第一制藥廠提供的生理鹽水、無水乙醇、多聚賴氨酸、75%酒精；天津化學(xué)試劑三廠提供的異丙醇，北京完達(dá)山提供的脫脂奶粉，美國Pierce公司提供的蛋白定量試劑盒、兔抗Caspase-3抗體、羊抗兔抗體等。

1.3實(shí)驗(yàn)主要儀器 美國Stoetling公司提供的51600型腦立體定位儀，山東新華醫(yī)療器械提供YX0602型蒸汽消毒器，日本島津提供VX4200S型動(dòng)物電子秤、BX63型自動(dòng)顯微鏡掃描儀、離心機(jī)、各顯微手術(shù)器械，黃石恒豐醫(yī)療器械提供的恒溫器，北京醫(yī)療器械廠提供的石蠟切片、外科手術(shù)各器械、微量移液器，日本Sanyo公司提供的超聲波細(xì)胞碎破儀，石家莊醫(yī)療器械提供的恒溫水浴箱、干燥箱、超聲工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、混合器，上海醫(yī)療器械廠提供的恒溫烤片機(jī)、DYY-12型電泳儀與DYCZ-24DN型電泳槽，北京中山生物提供的多功能酶標(biāo)儀，德國Eppendorf公司提供的微量移液器，美國Syngene公司提供的超低溫冰箱，北京六一儀器提供的制冰機(jī)，美國Imaging公司提供的圖像分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS提供的數(shù)碼相機(jī)。

1.4模型建立與分組 實(shí)驗(yàn)開始前使用抽簽法對90只大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，假手術(shù)組、模型組、井穴放血0、1、3、6 h組各15只。其中假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅僅分離其右側(cè)大腦中動(dòng)脈，不將線栓插入；模型組麻醉后向右側(cè)大腦中動(dòng)脈插入線栓阻塞血管，并在1 h后將線栓拔出，血流恢復(fù)，成功制備大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠模型；井穴放血各組采用與模型組相同的方法制備大腦中動(dòng)脈阻塞模型，并分別于梗死缺血再灌注后0、1、3、6 h，給予井穴放血治療，治療時(shí)間均為3 d。處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見》〔6〕中相關(guān)意見。

1.5井穴放血 選穴：選擇位于大鼠兩側(cè)前肢趾端井穴，每側(cè)選擇穴位6個(gè)，包括少商、中充、少?zèng)_、商陽、關(guān)沖、少澤，使用1.7 cm(0.5寸)毫針在各穴位上點(diǎn)刺放血1～3滴。

1.6神經(jīng)功能損傷 采用Longa評分法評價(jià)大鼠的神經(jīng)功能損傷情況〔7〕，0分：肢體功能正常；1分：提尾實(shí)驗(yàn)前肢無法完全伸直；2分：行走時(shí)有癱瘓情況，肢體向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠癱瘓，站立時(shí)向肢體癱瘓側(cè)摔倒；4分：大鼠無法站立行走，有意識(shí)障礙。分值越高提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.7梗死面積 大鼠均給予水合氯醛致死量腔內(nèi)注射，將腦取出置于緩沖液中3 min，后將腦轉(zhuǎn)至腦切片機(jī)內(nèi)切片，規(guī)格為1 mm，并浸入2%2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)中5 min。切片置于10%甲醛溶液內(nèi)，4℃過夜。TTC屬于物色染料，經(jīng)該染色后健康的組織呈紅色，反之無染色為梗死區(qū)。掃描儀掃描采集圖像，經(jīng)圖像分析軟件分析比較，為保證結(jié)果的可比性，應(yīng)取各大鼠相同部位腦組織腦片，經(jīng)掃描后的白色區(qū)域判定為壞死核心區(qū)，各切片梗死面積檢測3次，取平均值。注意測量期間任一無法確定梗死的區(qū)域均不納入。

1.8其他腦組織相關(guān)指標(biāo)表達(dá) 制作石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元水腫及壞死情況；經(jīng)免疫組化測定大腦膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞中Neun陽性細(xì)胞表達(dá)及Caspase-3陽性細(xì)胞的數(shù)量；同時(shí)采用Western印跡測定大鼠CD11b蛋白表達(dá)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件行方差檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Longa評分與梗死面積 假手術(shù)組無梗死病灶，無神經(jīng)功能異常與肢體癱瘓；模型組與井穴放血各組均有不同程度梗死病灶、神經(jīng)功能缺損癥狀，其中模型組Longa評分最高、梗死面積最大，后由高至低依次為井穴放血6、3、1、0 h組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2腦組織主要細(xì)胞與蛋白表達(dá) 假手術(shù)組GFAP陽性細(xì)胞、Caspase-3陽性細(xì)胞、CD11蛋白表達(dá)均最低，Neun陽性細(xì)胞表達(dá)最高；后依次為井穴放血0、1、3、6 h組，模型組GFAP陽性細(xì)胞、Caspase-3陽性細(xì)胞、CD11蛋白表達(dá)均最高，Neun陽性細(xì)胞表達(dá)最低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Longa評分與梗死面積、腦組織主要細(xì)胞與蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與井穴放血0 h組比較：3)P<0.05；與井穴放血1 h組比較：4)P<0.05；與井穴放血3 h組比較：5)P<0.05

3 討 論

腦梗死是因腦組織血流量灌注減少導(dǎo)致腦神經(jīng)組織凋亡或功能障礙的一種疾病，這類患者神經(jīng)功能障礙主要有視野缺損、反射減退、精神癥狀、麻木等。缺血性腦梗死在全部腦梗死中占比約為85%，主要因大小血管動(dòng)脈粥樣硬化、心臟起源性栓塞、小血管閉塞、全身低灌注等原因?qū)е隆?〕。目前，缺血性腦梗死的治療除了重組組織型纖溶酶原激活劑的應(yīng)用之外，尚未發(fā)現(xiàn)其他有效的治療手段能夠扭轉(zhuǎn)或抑制患者腦損傷，且在缺血性腦梗死神經(jīng)保護(hù)的相關(guān)研究尚未得到讓人滿意的進(jìn)展〔9〕。可見，缺血性腦梗死的早期有效治療依然是臨床研究的難點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡、壞死、免疫調(diào)節(jié)、炎癥、興奮性氨基酸、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)因子撤退等均是腦缺血級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的主要機(jī)制〔10〕。故針對缺血性腦梗死的發(fā)生發(fā)展有必要找到一種有效的神經(jīng)保護(hù)治療手段。腦梗死在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬腦中風(fēng)范疇，中醫(yī)認(rèn)為瘀血阻絡(luò)、脈絡(luò)受阻是疾病發(fā)生發(fā)展的基本病因，可導(dǎo)致肢體偏癱、半身不遂等情況，因瘀血阻滯、脈絡(luò)閉塞，引起血液循環(huán)不暢，經(jīng)脈氣機(jī)無法正常運(yùn)行，則肢體得不到濡養(yǎng)，故而誘發(fā)肢體麻木、廢痿不同等情況〔11,12〕。可根據(jù)疾病的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制為其采用祛瘀通絡(luò)、通筋活絡(luò)的治療原則。放血療法在我國歷史悠遠(yuǎn)，《素問·血?dú)庑兄尽分刑岬健胺仓尾∫蛳热テ溲保凇夺樈狻分刑峒傲朔叛煼ā霸逢悇t除之者，惡血出也”，故可以考慮給予腦梗死缺血再灌注損傷患者放血療法治療〔13〕。但目前與之相關(guān)的研究并不多見，特別是在發(fā)病早期的應(yīng)用更為少見。

放血療法的實(shí)施選穴極為關(guān)鍵，本研究中所選十二井穴是十二經(jīng)脈出處最淺之處，是各個(gè)經(jīng)絡(luò)連接微循環(huán)的連接點(diǎn)，對其進(jìn)行刺絡(luò)放血治療，有著“根有根本，終有終結(jié)”的價(jià)值。具體的十二井穴主要指四肢末端井穴，連接了頭面部各個(gè)相關(guān)部位，故頭面部、軀干各部位疾病均可以針刺十二井穴治療〔14,15〕。井穴放血治療可以幫助經(jīng)絡(luò)內(nèi)瘀阻的瘀血去除，增加脈絡(luò)中緩慢流行血流的速度，達(dá)到改善缺血再灌注損傷的目的。本研究結(jié)果證實(shí)，井穴放血治療對腦梗死缺血再灌注損傷的腦保護(hù)價(jià)值，且越早對大鼠進(jìn)行干預(yù)，其腦保護(hù)效果越好。早期井穴放血治療對腦梗死缺血再灌注損傷帶來的腦保護(hù)作用更為理想，這與阮建國等〔16〕研究結(jié)果一致。井穴放血療法對腦梗死后缺血再灌注損傷的腦保護(hù)機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、自由基堆積、興奮性氨基酸毒、炎癥因子異常表達(dá)等有關(guān)，興奮性氨基酸在腦缺血發(fā)生時(shí)大量釋放，聚集在胞外，因能量缺乏，機(jī)體對氨基酸的重?cái)z減少，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，故而加速神經(jīng)細(xì)胞的壞死；而在井穴放血治療后，可增加機(jī)體對氨基酸的重?cái)z，減少鈣離子內(nèi)流，從而延緩神經(jīng)細(xì)胞壞死〔17,18〕。