Hcy通過P38/MAPK 介導MCP-1表達與頸動脈硬化的機制

馬進軍 張家祥 李結華

(安徽醫科大學 1第一附屬醫院干部心血管內科，安徽 合肥 230032；2公共衛生學院)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管的重要危險因素之一，早發現、早診斷、早期干預顯得尤為重要。同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸的中間代謝產物，在體內主要通過甲基化途徑和轉硫途徑代謝，研究發現高Hcy血癥與頸動脈內-中膜厚度(IMT)和頸動脈狹窄呈正相關，是頸動脈硬化的獨立危險因素之一〔1〕。頸動脈因位置表淺、檢測方便無創被作為動脈硬化評估的指標。Hcy與AS的機制復雜，可能與氧化應激、內皮細胞功能障礙、細胞炎性因子等導致內皮細胞增殖有關〔2〕。單核細胞趨化蛋白(MCP)-1是促炎性因子，促進單核-巨噬細胞的遷移和組織浸潤，參與動脈硬化的形成和發展。本研究分析Hcy和頸AS的關系，同時通過體外培養人臍靜脈內皮細胞，檢測MCP-1的含量，探討Hcy引起動脈硬化的機制。

1 材料與方法

1.1研究對象與方法 納入2016～2017年安徽省直醫院住院的226例缺血性腦卒中患者，根據頸動脈超聲檢查結果分為頸動脈內膜正常組(91例)，內膜增厚組(24例)，斑塊組(100例)和狹窄組(11例)。納入標準：①年齡60～90周歲；②入院后完善血生化檢查和頸動脈彩超檢查；③無頸動脈支架或內膜剝脫術史；④病例資料完整。排除標準：①近期使用影響Hcy的藥物如B族維生素，甲氨蝶呤等；②甲狀腺功能異常；③肝腎功能異常；④認知障礙、不能配合檢查者。細胞培養實驗：原代培養的人臍靜脈內皮細胞，p38抗體、磷酸化p38抗體購自美國Santa cruz Biotechnology公司，MCP-1抗體購自美國Sigma公司。

1.2主要儀器 全自動生化分析儀，電泳儀DYY-10(Ecp3000 北京六一儀器廠)，TGL-18R冷凍離心機(珠海黑馬儀器廠)。

1.3Hcy水平測定 所有患者空腹12 h以上，晨起用生化管抽取靜脈血5 ml，迅速離心后使用全自動生化儀測量血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血尿酸(UA)、Hcy水平等指標。

1.4頸動脈超聲 采用Philips Epiq7C彩色多普勒超聲診斷儀，被檢查者平臥，檢測頸總動脈、頸動脈分叉處、頸內動脈，IMT，并觀察有無斑塊形成，狹窄程度及斑塊性質。選取雙側頸總動脈遠端及頸內動脈分叉膨大部1.0～1.5 cm血管壁，分別測量動脈前后壁內膜表面間垂直距離及管腔內膜界面為IMT，IMT<1.0 mm為正常，1.0≤IMT≤1.5 mm為IMT增厚，IMT>1.5 mm，斑塊凸向管腔為斑塊形成，頸動脈斑塊導致管腔狹窄>50%為頸動脈狹窄。

1.5人臍靜脈內皮細胞培養 培養基中加入不同濃度Hcy(0、1、10、100、1 000 μmol/L)，另將培養基分為對照組，Hcy組和Hcy+SB203580(p38通路特異性抑制劑)，實時定量聚合酶鏈反應(PCR)測定人血管內皮細胞MCP-1 mRNA水平，PCR產物(MCP-1 290 bp，GAPDH 454 bp)在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。MCP-1上游GCTGACCCCAAGAAGGAATG、下游TGAGGTGGTTGTGGAAAAGG、GAPDH上游CGTCCCGTAGACAAAATGGT、下游TTGATGGCAACAATCTCCAC。MCP-1和GAPDH的吸光度比值為mRNA的相對表達量。

1.6實時定量PCR檢測 提取人靜脈內皮細胞RNA，按照試劑盒操作步驟轉錄為cDNA，使用SYBR Green 燃料在實時定量PCR儀上進行上機檢測。

1.7Western印跡檢測 放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液提取人靜脈內皮細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定總蛋白濃度，質量相等的蛋白提取物經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移到硝化纖維素膜上進行蛋白印跡分析，以GAPDH作為內參。

1.8統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、χ2檢驗及Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1各組一般資料比較 各組年齡、性別、高血壓者比例、糖尿病者比例、體重指數(BMI)、TC、TG、LDL-C和血UA水平差異均無統計學意義(均P>0.05)；狹窄組HDL-C水平與內膜正常組差異有統計學意義；與內膜正常組相比，內膜增厚組、斑塊組及狹窄組Hcy水平明顯升高(P<0.05)，隨著IMT增加，血Hcy水平依次增加，見表1。

表1 各組一般資料分析

2.2頸動脈硬化程度影響因素 以頸動脈硬化分組為因變量，以Hcy水平為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，發現Hcy水平是內膜增厚、斑塊和狹窄的危險因素(P均<0.05)，見表2。

表2 頸動脈硬化程度影響因素Logistic回歸分析

因變量賦值，頸動脈硬化程度：正常=0，內膜增厚=1，斑塊=2，狹窄=3；自變量賦值，Hcy水平正常=0，增高=1

2.3不同濃度Hcy處理人臍靜脈內皮細胞MCP-1 mRNA表達 隨著Hcy劑量增加，MCP-1基因表達水平不斷升高(0、1、10、100、1 000 μmol/L Hcy處理MCP-1 mRNA表達分別為1.00±0.06、1.09±0.44、2.01±0.23、3.19±0.27、3.88±0.30)。

2.4Hcy處理人臍靜脈內皮細胞p38蛋白表達 與對照組(1.00±0.09)比較，Hcy組磷酸化p38水平(3.30±0.34)明顯升高，Hcy+SB203580組表達水平(1.82±0.38)顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組人臍靜脈內皮細胞p38蛋白表達

2.5使用SB203580后Hcy處理人臍靜脈內皮細胞MCP-1表達 與對照組(1.00±0.88、1.00±0.14)比較，Hcy組MCP-1 mRNA和蛋白(2.89±0.28、4.00±0.35)水平明顯升高，Hcy+SB203580組MCP-1 mRNA和蛋白水平(1.44±0.11、1.90±0.19)均顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組人臍靜脈內皮細胞MCP-1蛋白表達

3 討 論

AS是多數心血管疾病的病理學基礎，冠心病、缺血性腦血管性疾病等一旦出現難以逆轉的AS終末期病變，患者遠期死亡率將極大增加〔3〕。因此監測和控制亞臨床階段的AS就顯得尤為重要，頸動脈IMT(CIMT)測定是一種簡便、無創的利用超聲監測頸動脈壁的技術，它常被認為是早期AS的替代指標，被廣泛用于臨床篩查〔4〕。Hcy是一種含巰基氨基酸，來源于飲食中必需氨基酸甲硫氨酸的中間代謝產物。血清Hcy水平升高為心血管疾病的獨立危險因素，其水平與性別、年齡、葉酸水平、腎功能等因素有相關性。本研究發現Hcy水平與CIMT或頸動脈狹窄程度呈正相關，結果與前期研究結果一致〔5〕。同時，Hcy水平是頸動脈硬化的主要危險因素之一。

頸動脈硬化斑塊中含有大量炎性細胞浸潤，血管積聚大量的單核細胞和淋巴細胞，因此有研究提出AS病變的形成實際上是對內膜損傷做出的一系列炎癥反應，炎癥反應在AS的發生發展過程中發揮重要作用〔6,7〕。AS作為一種慢性炎癥疾病，內皮細胞受損后誘導炎性因子釋放是AS發生主要起始原因之一。前期研究〔8,9〕發現在動脈粥樣硬化斑塊中檢測到MCP-1等趨化因子含量的升高。MCP-1可誘導表達于內皮細胞、平滑肌細胞和單核細胞，不僅具有趨化單核細胞移動的功能，而且對血管內皮細胞黏附分子的表達具有調節作用，因而，在趨化吸引及調節單核細胞黏附和跨內皮遷移的過程中具有十分重要的作用〔10〕；另外，MCP-1 是細胞內與膽固醇的轉運及代謝過程密切相關的生物大分子，也參與了AS的病理過程〔11〕，本研究發現Hcy處理可增加人臍靜脈內皮細胞MCP-1水平，進一步論證了Hcy與MCP-1的關系。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細胞內，將細胞外信號轉導到細胞內引起細胞生物學反應〔12〕，p38MAPK是MAPK信號轉導通路的主要組成部分之一，在體內調控多種促炎因子的表達，同時在血管內皮細胞損傷中具有重要作用〔13〕。多數研究認為動脈粥樣硬化是炎癥驅動的過程，因此p38 MAPK的研究備受關注，有研究發現研究顯示，磷酸化p38 MAPK在大鼠AS斑塊組織中過度磷酸化，并且在血管內皮細胞中發現有p38 MAPK的表達〔14〕，磷酸化p38 MAPK通路可以促進MCP-1的大量表達，是其產生的關鍵上游分子〔15〕，本次實驗使用Hcy處理人臍靜脈內皮細胞發現，磷酸化p38的表達量明顯升高，使用SB203058，一種p38 MAPK特異性抑制劑，發現磷酸化p38的表達明顯降低；同時，使用SB203580后，Hcy處理人臍靜脈內皮細胞MCP-1表達水平明顯降低，表明p38 MAPK通路在Hcy介導MCP-1表達的作用機制。

本研究發現，血清Hcy濃度是CIMT增厚的主要原因之一，Hcy處理后MCP-1水平在AS發生發展中發揮重要作用；然而，本實驗樣本量有限，且未能得到人群MCP-1水平，在后期研究中需要加大樣本量并對其機制進行深入探討。