賴氨酸-甘氨酸共聚物的合成與性能研究

張雨欣，江世智，李 濤，王基偉，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.寧德師范學(xué)院閩東畬醫(yī)藥福建省高校工程研究中心，福建寧德 352100）

聚氨基酸作為以多肽鏈為主要結(jié)構(gòu)的聚合物，是一類具有生物活性的重要物質(zhì)。聚氨基酸類材料具有良好的穩(wěn)定性、生物相容性和可降解性〔1〕。不同種類氨基酸可以用來(lái)合成共聚物，并在水溶液中可自組裝形成納米粒子，在藥用載體、藥物控制釋放和組織工程等生物醫(yī)藥領(lǐng)域方面被廣泛研究〔2〕。

聚氨基酸作為一種極具發(fā)展前景的生物材料，對(duì)其進(jìn)行功能化修飾以更好地滿足生物醫(yī)藥、生物科技領(lǐng)域的需求具有重要的意義〔3〕。氨基酸側(cè)鏈上如果含有豐富的活性官能團(tuán)如羧基、氨基，這些官能團(tuán)為功能化聚氨基酸改性提供了有效位點(diǎn)，有利于擴(kuò)展其應(yīng)用〔4〕。目前聚氨基酸制備的常見(jiàn)問(wèn)題是聚合物的長(zhǎng)度易出現(xiàn)偏差，分子量分布相對(duì)較寬〔5〕，而生物醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)郯被岬姆肿恿考傲酱笮∮刑貏e要求〔6〕。因此，高效簡(jiǎn)便地合成粒徑大小可控、粒徑分布均勻，并使其具有豐富的可修飾的活性官能團(tuán)的聚氨基酸具有很重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文以六甲基二硅氮烷（HMDS）為引發(fā)劑，采用α-氨基酸-N-羧基酸酐（NCA）開(kāi)環(huán)聚合，通過(guò)控制反應(yīng)條件制備了一系列含有活性氨基的賴氨酸-甘氨酸共聚物Poly（KmGn），并對(duì)其結(jié)構(gòu)和相關(guān)性能進(jìn)行了研究。本研究為簡(jiǎn)便可控地合成聚氨基酸及聚氨基酸在生物領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸環(huán)內(nèi)酸酐（Lys（Z）-NCA）和甘氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐（Gly-NCA），成都蒽萊生物科技有限公司；HMDS，上海麥克林生化科技有限公司；乙醚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴化氫∕乙酸溶液（HBr∕CH3COOH，HBr 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%）和三氟乙酸（TFA），阿拉丁試劑有限公司；氘代二甲基亞砜（DMSO-d6），阿拉丁試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）經(jīng)氫化鈣干燥過(guò)夜后，減壓蒸餾備用。

核磁共振波譜儀（Bruker Advance III-400，德國(guó)Bruker 公司）；動(dòng)態(tài)光散射儀（Zetasizer Nano ZS∕ZEN3690，英國(guó)Malvern 公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，HitachiX650，日本日立公司）。

1.2 賴氨酸-甘氨酸共聚物Poly（K，G）的合成在氮?dú)猸h(huán)境中，將752.0 mg（0.002 5 mol）的Lys（Z）-NCA溶于5 mL 無(wú)水DMF 中，加入0.017 3 mL（4.798 mmol∕mL）HMDS 引 發(fā) 聚 合，室 溫 攪 拌3 d。再 將248.0 mg（0.002 5 mol）的Gly-NCA配成的DMF溶液加入上述反應(yīng)瓶中（摩爾比為1：1）繼續(xù)室溫反應(yīng)3 d。待反應(yīng)結(jié)束后將上述溶液轉(zhuǎn)移至500 mL 燒杯中，分3 次共加入150～200 mL 無(wú)水乙醚攪拌，觀察到有白色固體析出，置于4 ℃冰箱使產(chǎn)物充分沉降，過(guò)濾乙醚溶液得到產(chǎn)物置于真空干燥箱，45 ℃條件下干燥過(guò)夜。得到分子長(zhǎng)度為60 個(gè)氨基酸鏈段長(zhǎng)度的共聚物Poly［K（Cbz）30G30］。改變Lys（Z）-NCA和Gly-NCA 的投料比，投料比（Lys（Z）-NCA 與Gly-NCA 的摩爾比）分別為1.5：1、2：1，用相同方法制備了其他2 種共聚物Poly［K（Cbz）36G24］和Poly［K（Cbz）40G20］。

將得到的573.9 mg Poly［K（Cbz）30G30］溶于5.0 mL TFA 中，緩 慢 加 入0.06 mL HBr∕CH3COOH 混 合 溶液，于25 ℃攪拌反應(yīng)12 h后，在過(guò)量的乙醚中沉降、洗滌、過(guò)濾、干燥，將得到的固體溶解于無(wú)水乙醇，置于截留分子量為3 500的透析袋中，在蒸餾水中透析純化得到白色固體Poly（K30G30）。采用相同的處理方法得到另外2種共聚物Poly（K36G24）和Poly（K40G20）。系列聚氨基酸共聚物的合成路線圖見(jiàn)圖1。

圖1 聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）合成路線圖

1.3 賴氨酸-甘氨酸共聚物納米膠束的制備、粒徑及形貌測(cè)試將所制備的聚氨基酸溶于PBS 緩沖溶液，進(jìn)行超聲分散，靜置過(guò)夜，形成聚氨基酸納米膠束。采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）對(duì)制備的納米膠束的粒徑大小和分布進(jìn)行測(cè)試。將聚氨基酸溶于乙醇，超聲分散，將溶液放置在硅片上，使溶劑迅速揮發(fā)后用SEM進(jìn)行測(cè)試觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 賴氨酸-甘氨酸共聚物Poly（K，G）的結(jié)構(gòu)表征圖2A、B分別給出了系列聚合物Poly［K（Cbz）mGn］和Poly（KmGn）的核磁共振氫譜（1H-NMR），均以DMSOd6為溶劑。圖中x 峰和y 峰分別在3.5 和2.5 處，是DMSO-d6的溶劑峰。圖2A 中在δ=7.33 處的g 峰代表聚賴氨酸側(cè)鏈芐氧羰基保護(hù)中的苯環(huán)峰；δ=5.00處的f 峰表示與苯環(huán)直接相連的亞甲基峰；δ=2.96處的e 峰是聚賴氨酸側(cè)鏈δ 位碳的質(zhì)子峰；δ=1.64、δ=1.38、δ=1.25 處的b、d和c峰，是屬于聚賴氨酸側(cè)鏈中—（CH2）3—的質(zhì)子區(qū)。a峰和h峰在4.23和3.76處，代表賴氨酸和甘氨酸殘基的酰胺鍵，δ=4.23（br，1H，—COCH）與δ=3.76（br，1H，—COCH2）。以上2個(gè)峰的出現(xiàn)，說(shuō)明2種α-氨基酸-NCA發(fā)生了開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，成功制備出了系列聚合物Poly［K（Cbz）mGn］。同時(shí)根據(jù)兩處酰胺鍵質(zhì)子峰的積分面積比，可以計(jì)算出所制備的聚合物中2種組成單體的摩爾比與實(shí)際投料比非常接近，說(shuō)明反應(yīng)按照設(shè)計(jì)可控地進(jìn)行。圖2B中g(shù) 峰和f 峰基本消失，其他峰位略微偏移，說(shuō)明聚賴氨酸側(cè)鏈區(qū)域的N-δ-芐氧羰基的保護(hù)基已完全去除，已經(jīng)形成了系列Poly（KmGn）聚合物。

圖2 聚氨基酸共聚物Poly［K（Cbz）mGn］（A）和Poly（KmGn）（B）的核磁共振氫譜

2.2 賴氨酸-甘氨酸共聚物納米膠束的表面形貌觀察采用SEM 對(duì)所制備不同結(jié)構(gòu)的聚氨基酸納米膠束的表面微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究。聚氨基酸共聚物Poly（K30G30）膠束的電鏡圖片見(jiàn)圖3。由圖3 可以觀察到，所合成的聚氨基酸形成了粒徑分布均勻的球型膠束。在水溶液中，所制備的共聚物中的聚甘氨酸鏈段由于其疏水性作用形成了納米膠束的內(nèi)核；共聚物中聚賴氨酸鏈段由于側(cè)鏈上大量氨基的存在使其具有親水性，且聚賴氨酸具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，成為親水段并形成致密的外殼。因此，所制備的兩嵌段聚氨基酸可以在一定條件下自組裝形成具有穩(wěn)定空間立體結(jié)構(gòu)的兩親性納米膠束。同時(shí)，聚氨基酸納米膠束側(cè)鏈氨基的存在，可以對(duì)聚氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行各種功能化修飾，以滿足在生物技術(shù)及生物科技領(lǐng)域應(yīng)用的需求。

2.3 賴氨酸-甘氨酸共聚物納米膠束的粒徑及分布研究通過(guò)DLS 測(cè)定了系列聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）的粒徑及其分布。其中Poly（K30G30）粒徑大小及分布見(jiàn)圖4。從圖4 可以看出，Poly（K30G30）所形成膠束的平均粒徑大小為135.8 nm，且粒徑分布均勻。說(shuō)明通過(guò)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，采用HMDS引發(fā)劑引發(fā)NCA的開(kāi)環(huán)聚合可以很好地控制聚氨基酸的分子量及分布，使其具有合理的粒徑大小及分布。合理的粒徑的聚合物納米膠束可以通過(guò)高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)（EPR）被動(dòng)靶向傳輸?shù)侥[瘤，實(shí)現(xiàn)化療藥物的有效運(yùn)送，是其作為藥物載體的基本前提。

圖4 聚氨基酸共聚物Poly（K30G30）膠束的粒徑及粒徑分布

對(duì)一系列3種不同分子組成的聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）的粒徑大小進(jìn)行對(duì)比研究，以探討結(jié)構(gòu)對(duì)聚氨基酸膠束粒徑的影響。不同聚合物粒徑的具體結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 可以看出含有疏水性聚甘

氨酸嵌段最多的聚合物的膠束粒徑最大，而含有最少聚甘氨酸嵌段的聚合物膠束粒徑最小。說(shuō)明隨著疏水段的增加，納米膠束的粒徑隨之增大。這是由于聚合物在形成納米膠束的過(guò)程中，疏水段聚甘氨酸嵌段作為膠束的內(nèi)核，通常來(lái)說(shuō)膠束的內(nèi)核越大，膠束的粒徑也越大。結(jié)果也表明，可以通過(guò)調(diào)整親-疏鏈段在聚合物中的比例改變膠束粒徑的大小。

表1 聚氨基酸共聚物Poly（KmGn）單體組成及粒徑

3 結(jié)論

通過(guò)NCA 開(kāi)環(huán)聚合成功地制備了系列賴氨酸-甘氨酸共聚物，核磁共振氫譜證明所合成的聚合物結(jié)構(gòu)符合分子設(shè)計(jì)。所合成的系列聚氨基酸共聚物可以在水中自組裝形成粒徑分布均勻的納米膠束結(jié)構(gòu)。對(duì)于相同聚合度的共聚物，膠束粒徑大小與聚合物親-疏水段的組成比例有關(guān)。所合成的聚氨基酸的側(cè)鏈含有大量的氨基，便于進(jìn)一步進(jìn)行側(cè)鏈修飾。系列聚氨基酸共聚物的合成與性能研究對(duì)聚氨酸類納米粒子在生物技術(shù)及生物科技領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的意義。