產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌的耐藥機制及分子流行病學分析

謝斌云 ，劉媛 ，張偉 ，劉洋

（江西省南昌市第一醫院，1.創傷急救中心EICU；2.兒科NICU；南昌大學第一附屬醫院，3.呼吸內科；4.檢驗中心，南昌330000）

肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae，KP)是臨床常見腸桿菌科細菌之一依據細菌毒力和致病特點，可將肺炎克雷伯菌分為普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumoniae，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌 （hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP)。hvKP侵襲的宿主大部分為年輕健康的患者，且容易并發膿毒血癥，導致壞死性筋膜炎、骨髓炎、化膿性肝膿腫、眼內炎等嚴重的侵襲性疾病[1]。同時多臟器感染也因其可繼發遷徙性播散而存在，臨床致殘率及致死率高，預后差，近年來一直成為研究的熱點[2]。隨著頭孢類抗生素的大量應用及濫用，產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）也相繼出現增多的情況，導致產ESBL的耐藥菌譜出現交叉耐藥問題。細菌耐藥引發的醫院感染爆發流行，感染性疾病治療效果不佳，住院費用高，治療時間長，嚴重影響了人類健康，已經成為21世紀我們不得不面臨的公共衛生問題。而集毒力高、耐藥性強于一身的產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌或將成為下一個“超級細菌”。本研究對南昌大學第一附屬醫院2016年6月-2017年12月分離的產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌進行分析，探討耐藥機制及分子流行病學等，旨在為抗感染治療合理選用抗生素，預防和控制產ESBL耐藥菌的出現和播散，研制新型、高效的β-內酰胺類抗生素以及流行病學研究提供實驗依據和指導。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2016年6月-2017年12月南昌大學一附醫院就診患者分離的KP，若同一位患者多次分離出相同的菌株，只留取首次分離的菌株為標準。采用VITEK-2生物分析儀自動鑒定菌株和藥敏試驗。使用拉絲試驗確定高黏液表型特征，使用紙片法試驗確認ESBL表型。按l:1的比例各收集產ESBL酶hvKP、非產ESBL酶hvKP感染的患者的病歷資料，將上述45例產ESBL酶hvKP感染的患者記為病例組A組。對照組B組為隨機抽取的45例非產ESBL酶hvKP感染的患者。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603和大腸埃希菌ATCC25922，均購買于衛生部臨床檢驗中心。

1.2 黏液絲試驗 將細菌接種在5%綿羊血平板上，37℃培養16h后，用細菌接種環輕柔向上挑起平板上的肺炎克雷伯菌菌落，重復牽拉兩次或兩次以上，如果挑起的黏液絲長度大于或等于5 mm，判為黏液絲試驗陽性，反之則結果判讀為黏液絲試驗陰性。

1.3 產ESBL肺炎克雷伯菌進行表型確證試驗 推薦的紙片進行ESBL確證試驗，選取對三代頭孢菌素(頭孢曲松、頭孢噻肟)耐藥作為ESBL初篩標準，并記錄 ESBL陽性菌株分離率。將受試菌配成 0.5麥氏濁度菌液，用無菌棉棒挑取涂于MH瓊脂上，貼上頭孢他啶，頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟，頭孢噻肟/克拉維酸紙片在有待測菌的瓊脂培養基上，置于 35℃，16-18h后觀察結果，兩組中任何一組藥物，加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增加5 mm以上者，即判斷為ESBL菌株。

1.4 藥敏試驗 采用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏系統檢測，采用紙片擴散法測定試驗菌株對抗菌藥物的敏感性，抗菌藥物紙片分別為：頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟（FEP）、頭孢西丁（FOX）、亞胺培南（IPM）、頭孢他啶（CAZ）、氨曲南（ATM）、美羅培南（MEM）和厄他培南（ERT）及ESBL表型鑒定紙片頭孢噻肟／克拉維酸(CTX/CA)、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA）。參照CLSI標準進行實驗操作和結果判斷。

1.5 模板提取及PCR擴增條件 使用煮沸法提取臨床各種標本中分離出的肺炎克雷伯菌菌株DNA，PCR 的反應體系為 25μl： 正反引物各 0.5μl，DNA模板 3μl，mix 反應液 12.5μl，加蒸餾水使反應總體積為25μl，用無菌去離子水作為陰性對照。反應條件 ： 預 變 性 95℃ 5min；95℃ 45s，56℃ 90s，72℃90s，30 個循環；延伸 72℃ 10min。

1.6 產ESBL的高毒力肺炎克雷伯菌PCR鑒定將得到的PCR模板 （高毒力肺炎克雷伯菌DNA）進行擴增，12.5μl擴增體系：Taq Mix：6.25μl， 上游引物：0.25μl，下游引物：0.25μl，模板：1.5μl，ddH20：4.25μl；PCR 的反應條件：95℃預變性 5min，后 94℃變性 40s，52℃退火復性 30s，72℃延伸 1min 進行30個循環，最后72℃延伸10min。移液槍吸取6.5μlPCR擴增產物后加入1%瓊脂糖凝膠上樣孔中，120 V，電泳25 min，電泳液為 1×TAE緩沖液，電泳結束后在凝膠成像儀上觀察結果，記錄結果。

1.7多位點序列分析 (MLST)引物設計與合成：從PUBMLST 網站（http://pubmlst.org/koxytoca/info/K_oxytoca_primers.pdf）上查詢肺炎克雷伯菌多位點序列分型7對管家基因，引物參照相關文獻[3]，引物由上海生工公司合成。

1.8 脈沖場凝膠電泳 （PFGE）用低熔點瓊脂糖包埋細菌，做成瓊脂糖膠塊；用細胞裂解液和蛋白酶K消化，使得 DNA被釋放到細胞外；大片段的DNA用限制性內切酶消化；制備好的樣品按照設計好的程序電泳；電泳的結果通過染色后被讀取，通過相關軟件進行數據的分析。

2 結果

2.1 藥敏實驗結果 結果顯示：所有菌株對氨芐西林天然耐藥，產ESBL酶hvKP菌對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、環丙沙星、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率顯著高于不產ESBL酶hvKP菌株(P＜0.05)，然而在阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的耐藥率上差異無顯著意義 （P＞0.05），見表 1。

表1 產ESBL hvKP菌株和非產ESBL hvKP菌株對抗菌藥物的耐藥率的比較

2.2 ESBL的高毒力肺炎克雷伯菌普通PCR鑒定結果 從臨床分離的1263株肺炎克雷伯菌中篩出高毒力肺炎克雷伯菌株124株，其中K1莢膜血清型陽性85株，K2莢膜血清型陽性39株。在124株高毒力肺炎克雷伯菌中，表型試驗顯示45株為ESBL陽性hvKP菌株，79株為ESBL陰性hvKP菌株。經過表型試驗確定出的產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌株45株均攜帶ESBL基因，其中 blaTEM基因陽性22株，占48.9%；blaSHV基因陽性13株，占28.9%，其中7株為blaSHV-1型，6株為blaSHV-12型，其中一株同時攜帶blaSHV-1型和blaSHV-12型ESBL基因。bla CTX‐M基因陽性10株，占22.2%，見表 2。

表2 產ESBL高毒力肺炎克雷伯菌PCR擴增相關基因引物

此外，我們還發現部分ESBL相關基因可共存于同一菌株中，如表2.5所示，我們發現blaCTXM-1和blaTEM共存于一株K1型菌株中，另外還發 現 blaSHV-12+blaCTX-M-2、blaCTX-M-8+blaSHV-1+blaTEM、blaCTX-M-2+blaSHV-1+blaTEM、blaCTX-M-9+blaSHV-12+blaTEM、blaCTX-M-2+blaSHV-1+blaSHV-12共存的菌株各一株，且均為K2莢膜血清分型，這或表明K2型hvKP菌在獲得性耐藥上更具優勢。

2.3 MLST分型結果 產ESBL酶hvKP菌株共45株，其中K1莢膜血清型陽性28株，K2莢膜血清型陽性17株。K1莢膜血清型陽性菌株均為ST23型，而17株K2型產ESBL酶hvKP菌株中10株為ST65型，5株ST86型，2株ST14型。而攜帶ESBL基因的產ESBL酶hvKP則主要為ST23型、ST65型，見表3。

表3 ESBL陽性hvKP菌株ESBL相關基因的基因型分布

2.4 PFGE結果 45株產ESBL酶hvKP菌株經PFGE得到電泳圖譜。將具有85%以上相同條帶（相關系數＞0.85）的菌株歸入同一帶型，45株產ESBL酶hvKP菌株被分為6個型別：A型[71.1%（32/45）]、C 型[20.0%（9/45）]，B 型、D 型、E 型、F 型各1株。A型、C型為主要型別。其中A型進一步分為 3個亞型，A1型 [31.1%（14/45）]、A2型[35.6%（16/45）]A3 型[4.5%（2/39）]。

3 討論

肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae，KP)廣泛存在于自然界及機體中。人體的皮膚、呼吸道和消化道等部位均寄存著該細菌，當人體抵抗力下降時，免疫力低下，常引起機體出現多種感染，如肺炎、肝膿腫、敗血癥等等。在血瓊脂平板上生長，hvKP菌株可表現出高黏液性，研究[4-6]發現，hvKP表現為高毒力主要是攜帶有黏液表型調節基因和氣桿菌素。依據細菌抗原性不同以及莢膜多糖結構的異常，肺炎克雷伯菌可分為至少82個莢膜血清型[6]，其中，Kl、K2、K5、K20、K57 和 K54 血清型與人類及動物的各種侵襲性感染密切相關，為高毒力莢膜血清型肺炎克雷伯菌[7-9]。因新的抗生素的大量應用甚至濫用，耐藥問題也隨之凸現，產ESBLs是細菌產生多重耐藥的常見表型機制，具體耐藥根因可以從基因層面分析。這其中肺炎克雷伯菌是最常見的產ESBL菌株，常引起醫院感染暴發流行，給醫院管理及疾病診治帶來非常棘手的困難。現階段，無論是人類還是動物界，抗生素的使用過于頻繁，抗生素耐藥性問題越發嚴重。特別是頭孢類抗生素的大量應用及濫用，產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）也相繼出現增多的情況，導致產ESBL的耐藥菌譜出現交叉耐藥問題。

高毒力肺炎克雷伯菌的出現給臨床感染帶來了新的挑戰，其改變了對經典肺炎克雷伯菌感染的診治及流行。然而高毒力肺炎克雷伯菌在體外常表現出對除了氨芐西林外的其他抗生素高度敏感，故仍對其有相應的治療對策[10]。但隨著耐藥的廣泛流行，尤其是在各種抗生素濫用的情況下，抗生素耐藥已經成為影響臨床感染治療效果的重要因素。而此時，高毒力肺炎克雷伯菌也無法幸免。超廣譜β內酰胺酶是腸桿菌科細菌最常見的β內酰胺酶，其常常是導致腸桿菌科細菌β內酰胺類抗生素耐藥的重要原因。超廣譜β內酰胺酶根據同源性可分為TEM型、SHV型和CTX-M型等，其中前兩型最多見，世界范圍流行，我國以CTX-M型為主，而在本試驗中，我們卻發現hvKP菌株中主要為TEM和SHV型ESBL，這與以往的經典肺炎克雷伯菌報道不一致，或許與高毒力肺炎克雷伯菌獨特的耐藥發展特點有關。此外我們還發現hvKP菌株中同常常存在多種β內酰胺酶共存的情況，且多集中在K2型高毒力肺炎克雷伯菌中，這或許與K2型菌株的毒力相對較低有關[11]，這也表明K2型高毒力肺炎克雷伯菌或將成為高毒力肺炎克雷伯菌發展多重耐藥的重要突破口，也為我們監測高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌形成和發展提供了重要依據。由此可見，產ESBL酶的hvKP菌株的出現或給我們敲響了對高毒力肺炎克雷伯菌濫用抗生素治療警鐘，其中部分ESBL基因可通過質粒介導傳播、且集中在流行的克隆株上，也給我們的院感控制敲響了警鐘。加強對產ESBL酶hvKP菌株監測及相關研究，為未來控制高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌這一“超級細菌”的傳播提供理論依據。

與之前的研究文獻觀點有一致性[12-15]，本研究中K1血清學肺炎克雷伯菌的MLST分型主要以ST23型為主，K2血清學肺炎克雷伯菌主要以ST65型為主，在分子流行病學上，我們也發現雖然hvKP菌株的流行相對集中，以MLST分型結果看，K1型hvKP菌株主要集中在ST23型，但也存在少部分ST700型。相反，K2型hvKP菌株則略顯多態性，主要包括ST65型、ST86型及ST14型。而在耐藥基因攜帶上，我們發現所有ESBL基因陽性菌株主要集中在ST23型、ST65型及ST14型。本研究結果顯示本院分離出的產ESBL酶hvKP菌株的PFGE帶型相似性表現的比較明顯，提示本院各科室間產ESBL酶hvKP菌株或存在同類細菌的相關性傳播，鑒于此類現象，加強醫院感染預防措施和嚴格控制感染源及切斷傳播途徑意義重大，按無菌操作流程、接觸感染患者前后加強手衛生、強化消毒隔離制度等等措施應嚴格執行，最終將醫院感染的發生率降到最低。