MTA1表達與食管癌侵襲轉移的相關性及調控作用的研究

王學培 翟楊生 韓雪華

作為臨床最常見的惡性消化道腫瘤之一，食管癌(esophageal cancer,EC)具有發生發展迅速、侵襲范圍廣、轉移速度快、病死率高的特點[1]。依據現今的外科醫療條件，早期EC可通過根治性手術切除得到理想的治療效果[2]，而晚期EC一般采用手術與化療相輔助的治療方案，但是EC患者的術后再次復發以及癌細胞的不可控性轉移是導致EC患者死亡的最重要的因素之一[3]。隨著分子病理學在臨床應用技術上的突破，腫瘤細胞侵襲、轉移相關的分子研究逐漸應用在EC的診斷、治療中[4]。惡性腫瘤的基本特征就是侵襲和轉移，腫瘤相關蛋白1(metastasis-associated gene 1，MTA1)作為腫瘤轉移相關基因，其在多種腫瘤中過表達，且與腫瘤侵襲和腫瘤血管形成有關[5]。有文獻報道稱實體腫瘤發生的主要因素就是缺氧，局部缺氧會誘導激活缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)等，進而開啟血管生成開關，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路被激活，進而刺激血管和淋巴管生成[6]。有報道MTA1在大腸癌中表達與HIF-1α呈正相關，且能通過調節VEGF促進淋巴管生成[7]。而在EC中其促進轉移的機制筆者尚未見報道。本研究探討MAT1在EC中的表達，并探討腫瘤發生發展過程中的作用機制，旨在為臨床診治EC提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3月至2018年5月于我院接受手術治療的62例EC患者癌組織及距離癌組織>2 cm處的正常組織，所有病例標本經組織病理學檢測證實為原發性EC，其中腺癌32例，鱗癌30例；年齡35～76歲，中位年齡55歲。所有患者同意本研究并簽署知情同意書，且經醫院倫理委員會審核。

1.2 細胞及主要試劑和儀器 人正常食管上皮細胞HET-1A，人食管癌細胞株Eca-109、SHEEC1、Ec-9706、EC8712、TE-1均購自上海博古生物技術有限公司。慢病毒過表達載體RSK4-MTA1及陰性對照RSK4-NC由上海吉瑪生物技術有限公司提供；DMEM培養基(TOYOBO)；Trizol 試劑盒(TaKaRa)；Ⅰ、Ⅲ型膠原兔多克隆抗體(美國Abcamn公司)，MTA1抗體、HIF-α抗體、VEGF抗體、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(美國Jackson公司)，Transwell小室(美國BD公司)；CCK-8試劑盒、反轉錄試劑盒、Western blot試劑盒(美國migma公司)全蛋白抽提試劑盒(德國QIAGEN公司)，Lipofectamine-3000轉染試劑(美國vector公司)；PBS緩沖液(美Amresco公司)蘇凈Airtech超凈工作臺(北京六一儀器廠)，SANYO MCO-15AC細胞培養箱(美國強生公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司)；5810R 型高速離心機(日本島津公司)；Roche R480實時熒光定量PCR儀(美國Promega公司)，Multiskan MK3酶標儀(美國Corning公司)。

1.3 細胞培養以及轉染 將Eca-109細胞接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于生化培養箱中培養，條件37℃，5%CO2，融合度達85%時，胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期細胞進行轉染，采用Lipofectamine 3000通過脂質體介導法，將濃度均為100 nmol/L的RSK4-MTA1和RSK4-NC慢病毒載體轉染至細胞，轉染操作完成后，37℃，5%CO2常規培養細胞48 h后進行后續實驗。細胞分為RSK4-MTA1組、RSK4-NC組以及空白對照組(僅有Eca-109細胞，只加入Lipofectamine 3000試劑)。

1.4 組織及細胞RNA提取及qRT-PCR檢測MTA1的mRNA的表達 組織液和各細胞中總RNA依據Trizol法提取，并進行反轉錄，按照PrimeScrip反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，所有操作嚴格按照試劑盒要求執行。采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：①預變性：75℃，120 s；②變性：90℃，5 min；③退火：60℃，60 s；④延伸72℃，30 s；⑤ PCR儀采集熒光信號40個循環，U6作為內參(上游引物為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，MTA1 mRNA(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，相對表達量用2-ΔΔCT表示。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.5 平板克隆實驗檢測細胞增殖 調整細胞濃度，按每孔5×103個密度鋪6孔板繼續培養，隔周更換新鮮培養液，2周后用考馬斯亮藍染色，以>30個細胞的克隆記為1個菌落，在顯微鏡下觀察并拍照記錄菌落形成數量，每組設3個復孔，重復實驗3次。

1.6 Transwell小室檢測細胞侵襲 實驗前12 h更換為無血清培養基，將40 μl matrigel基質膠鋪于Transwell小室中，消化細胞并用1 μl PBS清洗2遍，將500 μl 無血清培養基加入24 孔板，取5×105細胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl 細胞懸液，保證下層完全培養基與Transwell小室間無氣泡。置于培養箱內正常培養 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結晶紫染液500 μl進行染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察顯穿過膜的細胞并拍照計數。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移 調整細胞濃度，以5×104個/孔接種于24孔培養板中，分組處理同上，繼續培養48 h，棄掉培養液，用10 μlsterile pipette 槍頭沿直線做劃痕，加入100 μl PBS將細胞碎片沖洗掉，然后無血清培養基，37℃、5%CO2溫箱培養，分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞運動情況以及劃痕寬度，計算細胞遷移的距離和細胞遷移率。

1.8 小管形成測定 按照文獻[8]方法進行小管形成實驗，即將50 μl Matrigel水平鋪板至96孔板， 37℃下固化0.5 h。將胰腺癌各細胞系細胞(2×104個細胞/孔)接種在基質膠上并在含有MTA1 miRNA的DMEM培養基中培養。 細胞在37℃含5%CO2的培養箱中孵育16 h，倒置顯微鏡下進行計數。

1.9 Western blotting檢測 將各組細胞濃度調整至1×106個/ml，加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清，采用ECA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入相應一抗， 4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

2 結果

2.1 MTA1在EC不同組織和細胞中的表達 qRT-PCR結果顯示，EC組織中MTA1的表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05)； MTA1在腫瘤細胞中的表達高于人正常食管上皮細胞HFT-1A(P<0.05)，其中在Eca-109細胞中表達量最高(P<0.01)。見表1、2。

類別MTA1EC組織0.956±0.537癌旁組織0.119±0.068*

注：與EC組織比較，*P<0.05

細胞MTA1HET-1A0.915±0.120Eca-1092.227±0.137*SHEEC11.666±0.122*#Ec-97061.712±0.084*#EC87121.407±0.062*#TE-11.366±0.088*#

注：與HET-1A比較，*P<0.05；與Eca-109比較，#P<0.05

2.2 細胞系構建 qRT-PCR結果顯示，RSK4-MTA1組細胞中MTA1的表達量明顯高于空白對照組和RSK4-NC組(P<0.05)，空白對照組和RSK4-NC組MTA1的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別MTA1空白對照組 1.019±0.054*RSK4-NC組 0.906±0.110*RSK4-MTA1組1.586±0.097

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

2.3 過表達MTA1對Eca-109細胞株增殖能力的影響 平板克隆實驗結果顯示，與空白對照組和RSK4-NC組相比，過表達MTA1后，RSK4-MTA1細胞克隆數明顯增多(P<0.05)。見表4，圖1。

2.4 過表達MTA1對Eca-109細胞株侵襲能力的影響 Transwell小室結果顯示，與空白對照組和RSK4-NC組相比，過表達 MTA1后，RSK4-MTA1組Eca-109細胞通過matrigel基質膠的數量明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖2。

表4 MTA1的表達對Eca-109細胞株增殖能力的影響 個,

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖1 MTA1的表達對Eca-109細胞株增殖能力的影響(平板克隆實驗檢測細胞增殖)

表5 MTA1的表達對Eca-109細胞株的侵襲能力的影響 個,

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖2 MTA1的表達對Eca-109細胞株的侵襲能力的影響(Transwell小室檢測細胞侵襲能力)

2.5 過表達MTA1對Eca-109細胞株遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果，與空白對照組和RSK4-NC組相比，過表達MTA1后，RSK4-MTA1組細胞運動能力明顯增強，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖3。

細胞細胞遷移率空白對照組 52.144±4.622*RSK4-NC組 55.534±4.279*RSK4-MTA1組91.499±5.218

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

2.6 MTA1對Eca-109細胞株小管形成的影響 評估MTA1對Eca-109細胞血管形成的影響，在空白對照組和RSK4-NC組中，細胞不能建立管狀結構網絡，而在RSK4-MTA1組中，16 h內 MTA1誘導癌細胞快速形成管狀結構網絡。小管形成測定的定量分析顯示，與空白對照組相比， MTA1過表達細胞中血管的數量明顯

圖3 MTA1的表達對Eca-109細胞株遷移能力的影響圖(劃痕實驗檢測細胞遷移能力)增加(P<0.05)。見表7，圖4。

表7 MTA1對Eca-109細胞系小管形成的影響 個,

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖4 MTA1對Eca-109細胞系小管形成的影響(小管形成的情況)

2.7 過表達MTA1對HIF-α/VEGF通路相關蛋白HIF-α、VEGF表達的影響 Western-blot檢測過表達MTA1對Eca-109細胞系中HIF-α/VEGF通路相關蛋白HIF-α及VEGF的影響，結果顯示，與空白對照組和RSK4-NC組比較，RSK4-MTA1組HIF-α及VEGF蛋白的表達量明顯增加(P<0.05)。見表8，圖5。

組別HIF-αVEGF空白對照組 1.209±0.386*1.064±0.134*RSK4-NC組 0.942±0.222*1.006±0.106*RSK4-MTA1組2.001±0.1872.330±0.391

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖5 MTA1與HIF-α/VEGF的作用關系(Western blotting檢測HIF-α/VEGF在Eca-109細胞中的表達)

3 討論

近年來，由于環境和日常膳食結構的變化，EC的發病率和致死率不斷攀升，嚴重危害人類的健康。目前缺乏根治性治療的外科手段，而EC的靶向治療尚處于起步階段[8]。有研究證實細胞內多種信號分子調控或者參與EC細胞的發生及癌細胞的侵襲和遷移，因此從分子基礎生物學角度出發尋找EC的發生、侵襲和轉移的標志物，為患者提供有效的治療方法有著重要的意義[9]。

MTA1是一種與腫瘤轉移相關的蛋白，其在多種上皮性惡性腫瘤中過表達，Toh等[10]從mRNA和蛋白水平研究發現MTA1在大腸癌組織中過表達，且其陽性表達率與淋巴結轉移成明顯正相關關系。有報道MTA1可與Ral-GTPase 結合激活原癌基因，導致細胞癌變的發生[11]。在對大量的前列腺癌、大腸癌、乳腺癌的臨床標本的研究中發現，MTA1 異常表達所引起的惡性腫瘤占很大比重[12]。另外，Xu等[13]研究發現下調MTA1的表達能明顯抑制前列腺癌細胞的生長、侵襲以及對外遷移。目前尚無明確的報道研究MTA1的表達與EC的侵襲轉移的關系。

本研究采用qRT-PCR檢測MTA1的mRNA在EC組織和癌旁組織中的表達發現，MTA1的mRNA在EC組織中表達水平高于癌旁組織(P<0.05)，且在食管癌細胞中的表達高于正常是管上皮細胞(P<0.05)。提示MTA1在EC的發生發展中可能起著重要作用。為觀察MTA1對食管癌的轉移的影響，本研究以EC細胞系Eca-109作為研究對象，通過慢病毒感染構建穩定MTA1過表達菌株，結果顯示RSK4-MTA1組細胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯增強(P<0.05)。

有研究發現MTA1能夠促進大腸癌旁淋巴管生成，而HIF-1α和 VEGF是腫瘤轉移和淋巴管形成的關鍵蛋白，正常供氧情況下，HIF-1α易被泛素蛋白酶降解，當缺氧時，HIF-1α降解緩慢，蛋白出現增多[14]。文獻報道HIF-1α可通過調控靶基因來影響淋巴生成，從而促進腫瘤轉移[15]，在大腸癌癌、乳腺癌以及口腔鱗狀細胞癌中已有文獻報道其能夠促進VEGF的表達，促進淋巴管生成[16]。本研究顯示在空白對照組和RSK4-NC組中，細胞不能建立管狀結構網絡，而在RSK4-MTA1組中，16 h內 MTA1誘導癌細胞快速形成管狀結構網絡，且與空白對照組相比， RSK4-MTA1組中血管的數量明顯增加(P<0.05)。Western-blot檢測MTA1過表達對Eca-109中HIF-α/VEGF通路相關蛋白HIF-α及VEGF的影響，結果顯示，與空白對照組相比較，RSK4-MTA1組HIF-α及VEGF蛋白的表達量明顯增加(P<0.05)，提示MTA1過表達能促進HIF-α及VEGF的表達。

綜上所述，食管癌組織中MTA1的表達較正常組織明顯增加，MTA1過表達可促進食管癌細胞Eca-109的增殖和侵襲能力，促進腫瘤細胞血管的形成，MTA1對食管癌腫瘤進展和血管形成可能通過調節HIF-α/VEGF信號通路實現的。