miRNA-lncRNA影響人NK細胞與樹突狀細胞免疫功能和乳腺癌細胞侵襲力的分子機制

李雅怡 張雨潔 卓文杏

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一。雖然早期檢測，手術和化療方面取得顯著進步，但乳腺癌患者的5年生存率仍然很低[1]。自然殺傷細胞(natural killer cells，NK)和樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是先天免疫的重要組成部分。增加的NK和DC介導的免疫反應與癌癥患者的結果呈正相關，故迫切需要找到針對NK細胞與DC免疫功能以及乳腺癌細胞增殖和轉移的新靶標。長非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一組具有超過200個核苷酸的非編碼RNA。已經在各種類型的癌癥中觀察到lncRNA的異常表達，并且在腫瘤進展中起到關鍵調節劑的作用[2]。lncRNA SNHG7通過抑制P15和P16的表達促進了乳腺癌細胞的增殖并抑制了細胞的凋亡[3]。據報道，lncRNA UCA1通過miR-195/ARL2信號通路增強膀胱癌的線粒體功能和細胞活力。lncRNA在腫瘤發生過程中起著不同的作用。lncRNA可以作為致癌基因或腫瘤抑制基因發揮作用[4]。在這些腫瘤抑制因子lncRNA中，lncRNA MEG3(母系表達的基因3)引起了很多關注。MEG3過表達通過PI3K途徑抑制子宮內膜癌細胞的增殖，侵襲和轉移[5]。 MEG3通過調節WNT/β-catenin信號通路抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖和轉移[6]。MEG3可通過靶向microRNA(miRNA)來調節腫瘤進展，miRNA是一組小的非編碼RNA[7]。MEG3通過抑制miR-183的表達抑制人神經內分泌腫瘤細胞的生長和轉移。MEG3通過靶向miR-93和抑制PI3K/AKT信號通路抑制膠質瘤細胞生長[8]。然而，MEG3是否通過靶向miRNA調節乳腺癌中的腫瘤進展尚不清楚。生物信息學預測顯示miR-21是乳腺癌中MEG3的靶標，過表達的MEG3可通過抑制miR-21的表達來抑制NK細胞與樹突狀細胞免疫功能和乳腺癌細胞侵襲力。本研究可能會為乳腺癌的治療找到新的藥物靶點，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院30例接受乳腺癌手術治療的患者，這些患者在2015年9月至2017年3月治療期間，未接受化療或放療。獲得了乳腺癌組織和鄰近正常組織，將組織立即在液氮中冷凍并儲存在-80℃。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①年齡30～60歲；②性別不限；③患者及全部接受乳腺癌手術。

1.2.2 排除標準：①有肝、腎、造血系統等嚴重原發性疾病者；②在組織采集前接受化療或放療的患者；③自身免疫性疾病患者。

1.3 方法 實驗分為4組：乳腺癌組織，正常組織，乳腺癌細胞系，正常細胞系。

1.3.1 乳腺癌細胞系和人胃上皮細胞系:乳腺癌細胞系(MCF7)和人乳腺上皮細胞系DU4475購自中國科學院細胞庫，并在RPMI1640培養基(Invitrogen公司，美國)中培養，補充有10%FBS(Gibco公司，美國)，37℃，5%CO2。

1.3.2 定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR):使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientfic)按照說明從細胞或組織中提取總RNA。使用PrimeScript TM RT-PCR試劑盒(TaKaRa，Kusatsu，Japan)通過使用1μg總RNA逆轉錄成cDNA。為了檢測MEG3和miR-21的表達，分別使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Thermo Fisher Scientific)和TaqMan miRNA測定法(TaKaRa)進行RT-PCR。 GAPDH和U6分別用作lncRNA和miRNA的內部上樣對照。通過相對量化(2-ΔΔCt)方法計算相對水平。所有實驗重復至少3次。

1.3.3 細胞轉染:為了增強MEG3外源表達，根據人MEG3(NR_002766)基因序列的GenBank，通過PCR合成MEG3序列的全長，并插入到pcDNA3.1空質粒(GenePharma公司，上海)中，稱為MEG3轉染?？召|粒作為對照(pcDNA3.1載體)。將乳腺癌細胞接種到96孔板中并培養以達到60%的轉染影響。根據Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific公司)制造商的說明書進行轉染。用于轉染的miR-21模擬物和miR-21對照的濃度為50 nmol/L。用于轉染的MEG3和對照載體的濃度為100 nmol/L。見表1。

表1 探針序列

1.3.4 細胞增殖試驗:細胞計數試劑盒-8(CCK-8)測定用于細胞增殖測定。將細胞接種在96孔板(每孔1×104個細胞)中，在37℃，5%CO2濕潤的培養箱中培養24 h。向每個孔中加入10 μl細胞計數試劑盒-8溶液(CCK-8)(Dojindo Laboratories公司，日本)，并在37℃，5%CO2濕潤的培養箱中孵育2 h。光譜儀Varioskan Flash用于測量450 nm吸光度。所有實驗重復至少3次。

1.3.5 遷移與侵襲測定:使用24孔transwell板(Corning公司，美國)進行Transwell測定以研究細胞的遷移和侵襲能力。對于侵襲測定，上室用50 μl基質膠基質包被。將數量為1×105的細胞以100 μl無血清培養基接種到上室中，其中600 μl DMEM在下室中補充有10%FBS。培養18 h后，用棉簽除去上室中的細胞，同時用Wright's-Giemsa染色法對下表面上的入侵或遷移細胞染色，并計數。對遷移實驗，添加5×104個細胞并且不使用基質膠基質。所有實驗重復至少3次。

1.3.6 生物信息學方法:MiRDB生物信息學工具用于預測研究中推定的MEG3靶標。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因測定:通過RT-PCR擴增含有miR-21靶序列的MEG3片段，然后插入pmirG10雙熒光素酶miRNA靶表達載體(Promega公司，美國)以形成報告載體MEG3-野生型(MEG3-WT)。另外的表達載體也通過插入突變的結合位點構建，并命名為MEG3-突變型(MEG3-MUT)。使用Lipofectamine 2000將MEG3-WT或MEG3-MUT和miR-21模擬物共轉染到乳腺癌細胞系中，并使用雙熒光素酶報告分析系統(Promega公司，美國)測試熒光素酶活性。

1.3.8 蛋白質印跡分析:通過使用RIPA裂解緩沖液(碧云天公司，上海)從細胞中提取蛋白質，并通過Bradford Protein Assay Kit(碧云天公司，上海)定量蛋白質濃度。通過10%SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白質，然后轉移到PVDF膜(EMD Millipore公司，美國)中。在室溫下用5%脫脂乳封閉1 h后，將膜與得自Abcam的一抗(抗-CD56；抗-CD80；抗-MMP2；抗-MMP-9和抗-GAPDH)在4℃下過夜。在室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)-連接的第二抗體溫育1 h后，通過電化學發光試劑盒(碧云天公司，上海)顯現信號強度。所有實驗重復至少3次。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和細胞系中MEG3下調表達 qRT-PCR分析乳腺癌組織和正常組織中lncRNA(MEG3)的表達，與正常組織相比，乳腺癌組織中MEG3表達下調(P<0.05)；與正常細胞系比較，乳腺癌細胞系中MEG3的相對表達降低(P<0.05)。表明MEG3在乳腺癌組織和細胞系中下調表達。見表2，圖1。

類別lncRNA正常組織 0.82±0.14乳腺癌組織 0.37±0.09正常細胞系 0.75±0.08乳腺癌細胞系0.24±0.05F值22.369P值0.001

圖1 qRT-PCR分析MEG3在乳腺癌組織和細胞系中的表達量

2.2 MEG3的過表達抑制NK細胞與DC細胞的活力 檢測lncRNA(MEG3)對NK細胞與樹突狀細胞(DC)免疫功能的影響，將MEG3轉染到乳腺癌細胞中來過表達MEG3，然后進行CCK-8測定。MEG3的過表達與對照轉染細胞相比，抑制NK細胞與DC細胞的活力(P<0.05)。見表3。

類別NK細胞DC細胞對照轉染 4.75±0.115.24±0.14MEG3轉染1.27±0.052.11±0.09t值6.5825.255P值0.0010.001

2.3 過表達的MEG3抑制乳腺癌細胞侵襲力 為研究lncRNA在乳腺癌細胞的腫瘤發生中可能的生物學功能，用MEG3轉染乳腺癌細胞以特異性地上調MEG3的表達。Transwell測定法測量遷移和侵襲能力。與對照轉染組相比，乳腺癌細胞中過表達的MEG3抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力。表明過表達的MEG3可抑制乳腺癌細胞的侵襲能力。見表4，圖2。

類別遷移細胞數目侵襲細胞數目對照轉染 283.74±24.15182.34±21.57MEG3轉染142.53±18.21123.98±19.46t值11.52416.818P值0.0010.02

圖2 不同轉染后細胞(Wright’s-Giemsa染色×200)

2.4 miRNA是lncRNA的靶標 為探索lncRNA在乳腺癌中的分子機制，通過生物信息學分析預測了推定的MEG3靶標。結果顯示在MEG3 mRNA中存在miRNA(miR-21)的結合序列(TAAGC)。為檢測miR-21是否是lncRNA的功能靶標，通過miR-21模擬物或對照轉染MEG3野生型(WT)和突變體(mut)細胞，檢測熒光素酶報告基因，結果顯示，與對照組相比，過表達的miR-21導致MEG3-WT熒光素酶活性降低，但對MEG3-mut報告基因的熒光素酶活性無明顯影響，表明miR-21和MEG3之間的直接靶向關系。見表5。

類別 MEG3-WTMEG3-mutmiR-21對照轉染 5.12±0.085.07±0.37miR-21模擬物轉染1.83±0.245.03±0.14t值5.328.34P值0.0110.183

2.5 過表達的MEG3減弱了miR-21模擬物對免疫侵襲相關蛋白的表達 為探索lncRNA和miRNA之間的潛在調節機制，進一步檢測了兩者對NK細胞和樹突狀細胞(DC)免疫功能及乳腺癌細胞侵襲力的影響。通過蛋白質印跡檢測NK細胞免疫功能標記蛋白(CD56)、DC免疫功能標記蛋白(CD80)和細胞侵襲標記蛋白(MMP-2和MMP-9)的表達，結果顯示，與miR-21對照相比，MEG3轉染后CD56、CD80、MMP-2和MMP-9的表達量下降(P<0.05)，而miR-21模擬物轉染誘導能夠上調CD56、CD80、MMP-2和MMP-9的表達(P<0.05)；與miR-21模擬物轉染組相比，MEG3的過表達導致CD56、CD80、MMP-2和MMP-9的表達量下降(P<0.05)。表明過表達的MEG3抵消了miR-21模擬物對NK細胞和DC免疫功能及乳腺癌細胞侵襲的促進作用。見表6，圖3。

類別CD56蛋白CD80蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白miR-21對照0.47±0.130.48±0.120.59±0.140.43±0.17miR-21對照+MEG3轉染0.21±0.08*△0.29±0.16*△0.20±0.03*△0.30±0.11 *△miR-21轉染0.96±0.12*#1.13±0.13*#1.35±0.16*#1.03±0.12*#MEG3+ miR-21轉染0.66±0.15*#△0.72±0.05*#△0.78±0.09*#△0.61±0.21*#△ F值9.748.369.5810.27 P值0.0000.0010.0000.000

注：與miR-21對照比較，*P<0.05；與miR-21對照+MEG3轉染比較，#P<0.05；與miR-21轉染比較，△P<0.05

圖3 不同轉染后相關蛋白的表達水平

3 討論

盡管已經實現了臨床治療的改進以改善臨床狀況，但具有晚期和遠處轉移的乳腺癌患者仍然具有非常差的預后，使得迫切需要發現針對NK細胞與DC免疫功能和乳腺癌細胞增殖和侵襲的新靶標。最近，已經鑒定出大量的LncRNA參與腫瘤進展并獲得了很多關注[9]。越來越多的證據支持LncRNA MEG3在各種類型的腫瘤中充當腫瘤抑制因子[10-12]。例如，在子宮內膜癌組織中發現MEG3表達降低，過表達的MEG3通過激活PI3K途徑抑制子宮內膜癌細胞增殖，侵襲，轉移和促進細胞凋亡[10]。 MEG3在乳腺癌組織和細胞系中也下調。過表達MEG3可抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲[11]。與鄰近正常組織相比，乳腺癌組織中MEG3水平降低，而下調MEG3與乳腺癌預后不良相關[12]。在我們的研究中，在乳腺癌組織和細胞系中觀察到MEG3的抑制表達。表明MEG3可能在乳腺癌中起到腫瘤抑制劑的作用。為了驗證我們的假設，在乳腺癌細胞系中MEG3轉染以增加MEG3的表達，我們發現過表達的MEG3抑制NK細胞與DC活性以及乳腺癌細胞的增殖和侵襲，這表明過表達的MEG3抑制了乳腺癌的腫瘤進展。

一些LncRNA可以作為miRNA的海綿或誘餌。一些LncRNA也可以與miRNA競爭結合mRNA或產生miRNA。上調的MEG3通過海綿狀癌中靶向E-cadherin的海綿狀miR-421抑制細胞上皮 - 間質轉化，MEG3的過表達通過miR-664的負調節抑制肝細胞癌細胞的增殖[13]。據報道，MEG3通過作為miR-19a的競爭性內源性RNA來抑制膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲[7]。在我們的研究中，生物信息學分析的結果表明miR-21可能是MEG3的潛在靶標。已證明MiR-21在癌發生中起促進作用。miR-21表達在結直腸癌組織中上調，miR-21通過抑制腫瘤抑制因子PTEN促進細胞生長和結腸直腸癌細胞的侵襲。miR-21的減少可以通過PTEN/PDCD4誘導細胞凋亡并抑制SK-N-SH細胞的增殖，表明miR-21可能在神經母細胞瘤發育過程中起著致癌作用[5-12]。本研究結果顯示，miR-21的過表達被MEG3抑制。此外，熒光素酶報告基因測定進一步證明了MEG3和miR-21之間的相互結合。因此，我們假設MEG3可通過抑制miR-21表達來抑制NK細胞與DC活性以及乳腺癌細胞的增殖和侵襲。

為探索MEG3和miR-21之間相互作用的確切分子機制，還將miR-21模擬物或MEG3轉染到乳腺癌細胞中。我們的結果顯示，與miR-21對照相比，MEG3轉染后NK細胞免疫功能標記蛋白(CD56)、DC免疫功能標記蛋白(CD80)和細胞侵襲標記蛋白(MMP-2和MMP-9)的表達下降，而miR-21模擬物轉染誘導能夠上調CD56、CD80、MMP-2和MMP-9的表達。總之，這些結果支持了我們的假設，即MEG3通過抑制乳腺癌細胞中的miR-21表達來抑制NK細胞與DC活性以及乳腺癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，乳腺癌組織和細胞系中MEG3的表達降低。 過表達的MEG3通過抑制miR-21表達在體外和體內抑制NK細胞與DC活性以及乳腺癌細胞的增殖和侵襲。 MEG3和miR-21在乳腺癌進展中的調節作用，并為乳腺癌治療提供了新的潛在治療策略。