近紅外二區成像中通過靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 早期診斷肝癌轉移實驗研究

李 佳，李 勇，占美曉，忻勇杰，趙 煒，陸驪工

肝癌是全球第5 大常見惡性腫瘤，外科肝切除術是首選治療方法，然而目前術后復發率高［1］。肝腫瘤周邊伴有微轉移灶，肉眼難以識別，為手術徹底切除病灶帶來一定困難［2］。 近年實時光學手術導航技術發展為此帶來新機遇，近紅外二區(second nearinfrared region，NIR-Ⅱ)成像較傳統近 NIR-Ⅰ成像穿透度更深、分辨率更高、自發熒光更少，故可極大提高術中成像靈敏度［3-4］。以肝癌高表達的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican,GPC)-3 為靶點，通過特異性靶向多肽［5］與熒光探針相偶聯，可大大提高熒光探針主動靶向肝癌的能力。 本研究通過構建靶向肝癌GPC-3 特異性NIR-Ⅱ熒光探針、肝癌裸鼠轉移模型［6］并在體觀測NIR-Ⅱ熒光區，探討NIR-Ⅱ成像對肝癌微小轉移灶早期診斷的優勢。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

硝酸銀(AgNO3)、牛血清白蛋白(BSA)、氫氧化鈉(NaOH)、 硫化鈉 (Na2S)(北京伊諾凱科技公司)，GPC-3 抗體(ab129381,英國 Abcam 公司)，人 LO-2、HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細胞系(北京中源合聚生物科技公司)，多肽TJ12P1(杭州中肽生化公司)，NIRvana 640ST 型 NIR-Ⅱ成像系統、 IVIS LuminaⅡ型小動物光學成像系統(中國科學院分子影像重點實驗室)。

1.2 實驗方法

納米探針制備：BSA 用超純水配制濃度為0.5%白蛋白溶液，濃度為0.1 mmol/L 硝酸銀水溶液緩緩滴入10 mL 白蛋白溶液，避光反應1 h；反應溶液中逐滴加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，調節溶液pH 至12；逐滴加入 0.4 mmol/L 硫化鈉水溶液，控制 Ag∶S離子摩爾比為1∶1，控制溫度40 ℃，避光反應過夜；所得溶液置于截留分子量為100 kD 半透膜透析袋中進行透析，冷凍干燥得到固體粉末；粉末重新溶解于磷酸緩沖液(PBS)，通過1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯法偶聯多肽片段TJ12P1，得到納米探針Ag2S@BSATJ12P1。

基本表征檢測：采用JEM-1200EX 型透射電子顯微鏡(TEM)獲得納米探針形貌結構電鏡圖，島津UV-3600 型紫外可見光分光光度計檢測紫外可見光吸收曲線，日立F-7000 型熒光分光光度計檢測熒光發射光譜。

穿透深度驗證：配制 0.1 mol/L Ag2S@BSATJ12P1 和等量IRdye800-CW 溶液作為對照，制備不同厚度冰凍雞胸肉切片覆蓋樣本并進行成像；采集780～900 nm 波段 NIR-Ⅰ信號和 1 100～1 300 nm 波段NIR-Ⅱ信號并采集數據，Light-field 軟件讀取信號值。

免疫印跡和免疫熒光驗證：取對數期生長LO2、HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細胞于共聚焦培養皿中貼壁生長，與Cy-5 染料標記的Ag2S@BSATJ12P1 共 孵 育 12 h；4',6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚(DAPI)對細胞核進行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察樣本熒光，Imaris 圖像分析軟件計算平均光密度(OD,平均OD=積分OD/區域全面積)，取平均值。

另取上述細胞樣品加入放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液，進行重懸，于冰上裂解30 min 行蛋白提取，依照電泳上樣量需要用水和5 倍體積上樣緩沖液(loading buffer)調整蛋白濃度，100℃煮沸變性,12%分離膠和5%濃縮膠行凝膠電泳，每孔上樣40 μg，控制濃縮膠恒壓 80 V，20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到達凝膠底部；300 mA 恒流轉膜2 h；5%脫脂奶粉封閉1 h，依次與一抗(1∶1 000)與二抗(1∶5 000)孵育，洗膜后暗室曝光、顯影并定影；以肌動蛋白(actin)為內參，Quantity One v4.6.2 軟件讀取并記錄GPC-3 相對表達水平。

1.3 活體NIR-Ⅱ成像與病理學驗證

收集對數生長期HCC-LM3 細胞，胰酶消化后用 PBS 重懸，調整濃度為 5×106個/mL，選取 6 周齡雄性Balb/c 小鼠并尾靜脈注射細胞懸液制備轉移模型，觀察小鼠體重及精神狀態變化。2 周后通過尾靜脈注射200 μg/mL Ag2S@BSA-TJ12P1 納米探針，分別在注射后 1、2、6、12、24、48 h 于 NIR-Ⅱ成像系統中成像。

2 結果

TEM 顯示Ag2S@BSA-TJ12P1 納米探針表征為量子點，粒徑約為10 nm(圖1①)；經多肽修飾后，吸收光譜可見400 nm 左右處有一特征性吸收峰，證明多肽與 Ag2S 成功偶聯(圖 1②)；NIR-Ⅱ熒光光譜可見最大發射峰位于波長1 080 nm 處，處于NIR-Ⅱ譜段(圖 1③)；IRDye-800CW 作為 NIR-Ⅰ對照，采用不同厚度凍雞胸肉遮蓋樣品并測試熒光穿透深度顯示，NIR-Ⅱ熒光較NIR-Ⅰ熒光具有更強的穿透深度(6 mm 對 9 mm)(圖 1④)。

圖1 Ag2S@BSA-TJ12P1 納米探針表征

圖2 Ag2S@BSA-TJ12P1 可特異性靶向肝癌細胞

免疫印跡檢測結果顯示，HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細胞GPC-3 表達均顯著高于LO2 細胞(圖 2①)。 Cy-5 染料標記納米探針 Ag2S@BSATJ12P1 并與4 種細胞共孵育后，激光共聚焦成像可見納米探針被 HepG2、MHCC97-H、HCC-LM3 細胞特異性攝取，而LO2 細胞幾乎不攝取(圖2②)。

裸鼠注射納米探針后 1、2、6、12、24、48 h 成像顯示，探針首先富集于肝臟區域，12 h 后探針信號對轉移灶具有最佳信噪比，48 h 后信號基本消失(圖3①)；離體肝臟可見數枚直徑約1 mm 微小轉移灶，散在分布于肝表面(圖3②)；蘇木精-伊紅(HE)染色組織病理切片可見病灶內大量異形細胞(圖3③)。

3 討論

肝癌早期以手術治療為主，中晚期治療包括介入為主的綜合治療［1,7］。 然而肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，診斷時多為中晚期。 肝癌外科手術過程中，術者判斷肝癌邊界通常依賴術中觸診和肉眼觀察，缺乏實時、客觀、有效的輔助方法。 活體熒光成像技術通過熒光靶向探針在腫瘤區域特異性富集，借助高靈敏度成像儀器，可在術中實時定位腫瘤，為術者徹底切除腫瘤提供實時反饋。 NIR-Ⅱ熒光成像(900～1 700 nm)與 NIR-Ⅰ熒光成像(750～900 nm)相比穿透強度更深，生物自發熒光更少，大大提高了腫瘤區域信噪比，有望突破現有光學手術導航的瓶頸［8-9］。 此外，熒光探針需與高特異性腫瘤抗體相耦合，以實現對腫瘤長效、穩定標記，滿足外科醫師對術中導航的時間要求。 近年研究表明，GPC-3 作為肝癌特異性標志物在肝癌發生發展過程中具有重要作用，高達90%患者肝癌表面存在GPC-3 高表達，為肝癌精準靶向與診療提供了重要證據［10］。

本研究所設計的Ag2S@BSA 納米探針在NIR-Ⅱ區具有優越的光學性質，將熒光探針與GPC-3 特異性靶向多肽TJ12P1 通過EDC-NHS 交聯法相耦合獲得靶向探針Ag2S@BSA-TJ12P1，大大增強了熒光探針靶向性，并實現了肝癌原發灶與轉移灶長效、穩定標記。 裸鼠肝癌轉移模型體外實驗證實，本研究設計的Ag2S@BSA-TJ12P1 熒光探針與傳統NIR-Ⅰ熒光探針(IRdye800-CW)相比，NIR-Ⅱ成像具有更強的穿透深度，更少受到生物自發熒光干擾；在體實驗證實，Ag2S@BSA-TJ12P1 熒光探針NIR-Ⅱ成像可成功觀測到最小為1 mm 肝癌轉移灶，并經病理證實。

綜上所述，本研究結果在肝癌轉移灶精準診斷及熒光手術導航方面具有一定的轉化前景。 但本研究也有局限性，所應用的裸鼠肝癌轉移模型模擬肝癌血行轉移病理情況，可能較人類肝癌肝內轉移位置及特性存有一定差異，需要結合更多疾病動物模型加以驗證，以及進一步優化靶器官成像時間窗等加以探討。