血清組織蛋白酶D檢測在非酒精性脂肪性肝病中的臨床意義

王茜青， 洪 娟， 杜 超， 褚慶華

（1.上海市浦東新區浦興社區衛生服務中心檢驗科，上海 200129；2.同濟大學附屬第十人民醫院檢驗科，上海 200072）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝臟硬變性疾病，其疾病進展與肝炎、肝纖維化乃至肝細胞肝癌的發生相關[1]。目前，肝臟穿刺活檢是診斷NAFLD的“金標準”，但由于其有創，操作要求高，無法實現快速實時的檢測需求，并存在一定的取樣誤差，無法作為NAFLD分級診斷的常規方法[2]。因此，臨床亟需用于NAFLD早期診斷及進展評估的新型、敏感且特異的血清學指標。組織蛋白酶家族是人溶酶體內重要的水解酶家族，共有15個成員[3]，其中組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）是被發現最早，且報道最多的一個成員，不僅在溶酶體內降解蛋白質，還能分泌至細胞外發揮作用[4]。有研究結果顯示，CTSD不僅參與了炎癥反應過程，同時也是脂質堆積和代謝通路的重要功能蛋白，其與動脈粥樣硬化、腫瘤等多種慢性疾病的發展密切相關[5-7]。目前，丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）等血清學指標已作為NAFLD的常規輔助診斷項目，但對于NAFLD的分級缺乏特異性和敏感性。因此，本研究擬探討CTSD、ALT、AST等指標聯合檢測在NAFLD中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年3月—2019年3月同濟大學附屬第十人民醫院確診的NAFLD患者356例，年齡（48.87±6.98）歲，參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2018年更新版）》[1]相關診斷標準確診。按疾病嚴重程度將NAFLD患者分為輕度組（146例，其中男84例、女62例）、中度組（113例，其中男66例、女47例）和重度組（97例，其中男55例、女42例）。納入和排除標準：（1）就診資料、治療經過等病史記錄完整；（2）無飲酒史或飲酒折合乙醇量＜140 g/周（女性＜70 g/周）；（3）排除病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等可導致脂肪肝的特定肝臟疾病；（4）排除藥物、甲狀腺功能減退以及與胰島素抵抗相關的綜合征等特殊情況；（5）排除正在服用或近期內曾服用可導致肝臟酶譜升高的藥物者。選取同期同濟大學附屬第十人民醫院體檢健康者300名（正常對照組），其中男171名、女129名，年齡（47.58±5.66）歲，腹部B超、生化檢查均正常。本研究經同濟大學附屬第十人民醫院倫理委員會批準，所有對象均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

采用真空采血管采集所有對象清晨空腹靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，待自然凝集后1 000×g離心10 min，分離血清，置于-70 ℃保存，統一檢測。

1.3 方法

采用紫外連續監測法檢測ALT、AST、γ-谷氨酰基轉移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT），采用終點法檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C），試劑盒均購自瑞士羅氏公司，檢測儀器為cobas c702全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）。采用酶聯免疫吸附試驗檢測CTSD，試劑盒購自武漢優爾生公司，標準曲線r2=0.974 6，線性范圍為46.88～3 000.00 pg/mL，最低檢測限為20.32 pg/mL，批內、批間變異系數分別為10%、12%。檢測儀器為ELx800酶標儀（美國BioTek公司）。嚴格按試劑和儀器說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用Graphpad 7.0軟件及SPSS 21.0軟件進行統計分析。采用Kolmogrrov-Smimov檢驗進行正態性檢驗。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。采用Pearson相關分析和Spearman等級相關分析評估各項目之間及與NAFLD嚴重程度的相關性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標診斷NAFLD的價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NAFLD組與正常對照組各項指標的比較

NAFLD組血清ALT、TC、TG、LDL-C、CTSD水平高于正常對照組（P＜0.01），且NAFLD各組之間差異亦有統計學意義（P＜0.01）。NAFLD組血清AST、GGT水平高于正常對照組（P＜0.01），且NAFLD重度組高于中度組（P＜0.01）。NAFLD輕度組與正常對照組之間血清AST、GGT水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 正常對照組與NAFLD組各項指標的比較 ±s

表1 正常對照組與NAFLD組各項指標的比較 ±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與輕度組比較，#P＜0.01；與中度組比較，△P＜0.01

組別 例數 ALT/（U/L） AST/（U/L） GGT/（U/L）NAFLD組 356 40.60±16.32* 35.21±13.86* 46.31±24.26*輕度組 146 31.34±8.06* 27.69±7.36* 34.15±14.34*中度組 113 40.09±9.05*# 32.65±8.58*# 45.95±18.46*#重度組 97 55.9±20.26*#△ 50.16±14.59*#△ 65.76±29.37*#△正常對照組 300 24.70±9.61 27.65±7.27 35.00±13.39組別 TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL-C/（mmol/L） CTSD/（pg/mL）NAFLD組 1.95±0.50* 5.52±0.97* 3.65±0.55* 18.45±7.18*輕度組 1.61±0.30* 4.91±0.49* 3.38±0.33* 14.25±3.53*中度組 2.00±0.33*# 5.41±0.36*# 3.59±0.3*# 18.31±5.72*#重度組 2.44±0.47*#△ 6.67±0.73*#△ 4.19±0.46*#△ 25.24±7.58*#△正常對照組 1.01±0.48 2.81±1.37 1.95±1.00 7.20±3.76

2.2 血清CTSD水平與NAFLD嚴重程度的相關性

Spearman等級相關分析結果顯示，血清CTSD水平與NAFLD嚴重程度呈正相關（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。見圖1。

圖1 血清CTSD與NAFLD嚴重程度的相關性分析

2.3 血清CTSD與ALT、TC和LDL-C的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示，CTSD與ALT、TC、LDL-C呈正相關（r值分別為0.541、0.662、0.571，P＜0.01）。見圖2。

2.4 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的價值

ROC曲線分析結果顯示，CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.940、0.822、0.627，最佳臨界值分別為12.67、38.00、53.00，敏感性分別為76.97%、51.69%、34.55%、特異性分別為91.33%、93.00%、92.33%。CTSD與ALT聯合檢測診斷NAFLD的AUC為0.960，敏感性和特異性分別為88.48%和90.00%。見表2、圖3。

圖2 CTSD與ALT、TC和LDL-C的相關性分析

表2 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的ROC曲線參數

圖3 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的ROC曲線

3 討論

NAFLD是常見的慢性肝病，威脅著全世界20%～30%成人的身體健康[8]。大多數NAFLD患者合并有代謝性疾病，如肥胖、糖尿病及脂類代謝紊亂等。肝臟的脂肪變性在早期階段通過運動、飲食、藥物等的調節是可以逆轉的，因此NAFLD的早期診斷對于治療尤為關鍵[9]。The Protein Atlas數據庫顯示肝細胞內富含CTSD蛋白。一項由美國、芬蘭合作的多中心研究結果顯示，在西方人群中，血漿CTSD水平與NAFLD的進展密切相關，且可用于預測NAFLD的療效[10]。目前尚無我國人群CTSD水平與NAFLD分級關系的相關報道。本研究結果顯示，血清CTSD水平與NAFLD分級呈正相關（rs=0.800 5，P＜0.000 1），且與血清ALT水平呈正相關（r值分別為0.541，P＜0.01）。本研究結果還顯示，NAFLD輕度組血清CTSD水平高于正常對照組（P＜0.01）；而作為脂肪肝輔助診斷指標的ALT、AST，在正常對照組與NAFLD輕度組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，CTSD或可作為新的NAFLD輔助診斷指標。

肝臟是合成、儲存、轉運和分解脂質的重要器官及場所，在脂質代謝中發揮重要作用。肝臟一旦發生脂質代謝異常，脂質沉積會引起肝細胞脂肪變性，同時誘導氧化應激、肝細胞損傷及炎性細胞浸潤，導致NAFLD發生，嚴重者可發展為不可逆的肝病，如肝硬化、肝癌等。有研究結果顯示，非酒精性肝炎、動脈粥樣硬化等慢性炎癥疾病會引起巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積，而組織蛋白酶在調節炎癥反應和膽固醇轉運的通路中是不可或缺的重要蛋白[11-12]。本研究結果顯示，CTSD與TG、TC呈正相關（r值分別為0.662、0.571，P＜0.01），與文獻報道一致[10]。

CTSD是溶酶體中主要的水解酶，存在于哺乳動物所有的細胞和組織中，在細胞中發揮剪切、降解多種蛋白質和多肽的作用，并參與免疫調控進程。正常情況下，巨噬細胞內脂蛋白中的膽固醇通過溶酶體水解成為游離膽固醇，被釋放進入細胞質，降解為膽汁酸前體。與膽固醇結合的溶酶體大量增加會引起溶酶體酶轉運通路的紊亂，從而使血液中的溶酶體酶水平升高。在高膽固醇環境下，細胞內的CTSD水平升高并定位于細胞膜附近，極易被釋放入血。這就導致在肝臟脂肪變性的過程中，血清CTSD水平升高。有研究結果顯示，CTSD參與了炎癥反應及膽固醇轉運通路的調節[13]。WALENBERGH等[14]的研究結果顯示，血漿CTSD水平與兒童NAFLD密切相關。MOALLEM等[15]的研究結果顯示，CTSD與頸動脈內膜中層厚度有關，可作為動脈粥樣硬化新的指標，CTSD水平還與溶酶體貯積癥的發病有關。本研究發現，NAFLD組血清CTSD水平明顯高于正常對照組（P＜0.01），且與NAFLD嚴重程度呈正相關（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。ROC曲線分析結果顯示，血清CTSD診斷NAFLD的效能優于ALT及GGT，且可用于鑒別診斷早期NAFLD，更適合于亞健康人群的篩查。

綜上所述，CTSD與NAFLD的進展密切相關，或可作為NAFLD早期診斷及分級的標志物，與ALT聯合檢測有助于NAFLD的早期診斷和干預。