目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)的鑒別能力評(píng)價(jià)

彭 政， 唐 寧， 鄒志平， 肖 芳

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430030；2.積水醫(yī)療科技有限公司，湖北 武漢 430030；3.湖北省第三人民醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430030）

活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）延長(zhǎng)的潛在原因可分為三大類(lèi)：缺乏凝血因子、存在凝血因子抗體、存在狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）。凝血因子自身抗體可對(duì)人體凝血產(chǎn)生重要影響，其中最為常見(jiàn)的凝血因子自身抗體就是凝血因子Ⅷ抗體[1]。獲得性血友病是一種在非血友病患者循環(huán)血中以出現(xiàn)凝血因子Ⅷ特異性自身抗體為特征的出血性、自身免疫性疾病，臨床較為罕見(jiàn)，因出血突然且嚴(yán)重，患者常因延誤診斷而死亡[2-3]。血友病是遺傳性凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ缺陷所致的一種出血性疾病，患者在創(chuàng)傷或手術(shù)中出血嚴(yán)重，常會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重合并癥。LA與多發(fā)性血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血小板減少癥有關(guān)，患者通常不伴出血，隱蔽性強(qiáng)，故對(duì)LA進(jìn)行早期篩查尤為重要[4-5]。

目前，凝血因子Ⅷ抗體和LA的確證試驗(yàn)有相關(guān)特定因子定量分析、改良Bethesda法、稀釋蝰蛇毒時(shí)間（Russell viper venom time，RVVT）法和硅化凝血時(shí)間（silicon clotting time，SCT）法，但這些方法成本高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，會(huì)一定程度延誤患者救治。針對(duì)這一難題，國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)推薦使用APTT混合糾正試驗(yàn)，可快速判斷凝血異常是由凝血因子低下或缺乏引起，還是由抑制劑（如LA、凝血因子抑制劑）引起，幫助實(shí)驗(yàn)室明確檢測(cè)方向[6]。但目前暫無(wú)公認(rèn)的APTT混合糾正試驗(yàn)檢測(cè)方法和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室使用的標(biāo)準(zhǔn)不一，對(duì)“糾正”的理解也存在差異。因弱抑制劑可在1∶1混合的狀態(tài)下被充分稀釋而消失，故當(dāng)APTT、凝血酶原時(shí)間只是稍微延長(zhǎng)時(shí)，APTT混合糾正試驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定的偏差。由于上述種種原因，使得開(kāi)展APTT混合糾正試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室不多。本研究旨在評(píng)價(jià)目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)的鑒別能力，并將其與傳統(tǒng)Rosner指數(shù)法進(jìn)行比較。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院APTT延長(zhǎng)患者標(biāo)本62例，所有標(biāo)本均經(jīng)確證試驗(yàn)確認(rèn)，延長(zhǎng)原因明確，其中22例為凝血因子Ⅷ抑制劑陽(yáng)性標(biāo)本，20例為內(nèi)源性凝血因子缺陷標(biāo)本，20例為L(zhǎng)A陽(yáng)性標(biāo)本。未能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本-80 ℃（6個(gè)月）或-20 ℃（14 d）冷凍保存。采用CP2000凝血分析儀及APTT試劑[積水（日本）醫(yī)療株式會(huì)社]進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 正常混合血漿的制備

收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院新鮮凝血試驗(yàn)標(biāo)本20例，所有標(biāo)本凝血四項(xiàng)結(jié)果均在正常范圍內(nèi)，且無(wú)溶血、無(wú)黃疸，排除妊娠、肝炎病毒陽(yáng)性及人體免疫缺陷病毒抗體陽(yáng)性的患者標(biāo)本[7]。標(biāo)本充分混勻后，1 500×g離心10 min，取上層血漿于無(wú)菌杯中，并分裝于Eppendorf管中。同時(shí)取2份適量血漿，一份直接進(jìn)行凝血四項(xiàng)檢測(cè)，另一份置于37 ℃水浴箱中溫育1 h，再進(jìn)行凝血四項(xiàng)檢測(cè)。若2份標(biāo)本凝血四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均正常，則將該標(biāo)本置于-80 ℃保存[8]。本研究因自制血漿成本低，使用方便，故未使用商品化正常混合血漿，但自制正常混合血漿不宜多次反復(fù)凍融。

1.4 方法

1.4.1 目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn) 將正常混合血漿于37 ℃水浴箱中復(fù)融5 min。（1）即時(shí)型糾正試驗(yàn)。將正常混合血漿、患者血漿直接上機(jī)檢測(cè)，設(shè)置兩者混合比例模式；（2）延遲型糾正試驗(yàn)。手工配置正常混合血漿和患者血漿混合比例，充分混勻后于37 ℃水浴箱中溫育2 h[9]，再上機(jī)檢測(cè)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)流程

表1 目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)血漿混合比例

為了更加客觀地評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果，需對(duì)面積比（area rotio，AR）值進(jìn)行分析。根據(jù)AR值將結(jié)果圖分為3種曲線型：抑制劑型、缺陷型和可疑抑制劑型[10]。在一個(gè)矩形中，對(duì)角線將其分為下三角形（Ⅰ區(qū)）和上三角形（Ⅱ區(qū)），當(dāng)Ⅰ區(qū)面積等于Ⅱ區(qū)面積時(shí)，AR值為100%。當(dāng)Ⅰ區(qū)面積大于Ⅱ區(qū)面積時(shí)，為凸曲線型，即抑制劑型（AR≥108%）；當(dāng)Ⅰ區(qū)面積小于Ⅱ區(qū)面積時(shí)，為凹曲線型，即缺陷型（AR≤94%）；另有可疑抑制劑型（AR為95%～107%），圖形近似直線，但不能被歸為凸曲線型，該類(lèi)型提示可能包含凝血因子抑制劑。見(jiàn)圖2。

圖2 模擬模式識(shí)別曲線

1.4.2 Rosner指數(shù)法 將正常混合血漿于37℃水浴箱中復(fù)融5 min。按Rosner指數(shù)法常用血漿的配置要求，配制1～3管血漿，管1正常混合血漿0.5 mL，管2正常混合血漿0.25 mL+患者血漿0.25 mL，管3患者血漿0.5 mL。將管1～3上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算Rosner指數(shù)，即（1∶1混合血漿APTT—正常混合血漿APTT）/患者血漿APTT×100%。Rosner指數(shù)＞11提示可能為抑制劑型，Rosner指數(shù)＜11提示可能為缺陷型。

將3管血漿于37 ℃水浴箱中溫育1 h后，檢測(cè)管2 APTT，同時(shí)將溫育后的0.25 mL管1血漿與0.25 mL管2血漿混合，立即檢測(cè)APTT，記錄APTT差值。若差值＞10 s，則判斷為存在時(shí)間依賴(lài)性抗體。

2 結(jié)果

2.1 凝血分析儀檢測(cè)結(jié)果

即時(shí)反應(yīng)曲線呈凹曲線型，延遲反應(yīng)曲線呈凸曲線型，提示存在凝血因子抑制劑，見(jiàn)圖3。即時(shí)反應(yīng)與延遲反應(yīng)曲線均呈凸曲線型，提示存在LA，見(jiàn)圖4。即時(shí)反應(yīng)與延遲反應(yīng)曲線均呈凹曲線型，提示凝血因子缺陷，見(jiàn)圖5。

2.2 Rosner指數(shù)法與目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)于20例凝血因子缺陷標(biāo)本，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)與Rosner指數(shù)法均能100%檢出，見(jiàn)表2。對(duì)于20例LA陽(yáng)性標(biāo)本，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)與Rosner指數(shù)法均檢出19例（7號(hào)標(biāo)本2種方法均未能檢出），見(jiàn)表3。對(duì)于22例凝血因子抑制劑陽(yáng)性標(biāo)本，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)檢出21例（1號(hào)標(biāo)本未能檢出），50%點(diǎn)差值法檢出21例（6號(hào)標(biāo)本未能檢出），見(jiàn)表4。

2.3 3種方法檢測(cè)凝血因子缺陷、LA及凝血因子抑制劑的敏感性

圖3 凝血因子抑制劑標(biāo)本曲線

圖4 LA標(biāo)本曲線

圖5 凝血因子缺陷標(biāo)本曲線

表2 凝血因子缺陷組2種方法驗(yàn)證結(jié)果

表3 LA組2種方法驗(yàn)證結(jié)果

表4 凝血因子抑制劑組2種方法驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)于凝血因子缺陷標(biāo)本，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)與Rosner指數(shù)法的敏感性均為100.0%。對(duì)于LA陽(yáng)性標(biāo)本，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)與Rosner指數(shù)法的敏感性均為95.0%。對(duì)于凝血因子抑制劑陽(yáng)性標(biāo)本，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)與50%點(diǎn)差值法的敏感性均為95.5%。

3 討論

APTT混合糾正試驗(yàn)是分析APTT延長(zhǎng)原因簡(jiǎn)單而實(shí)用的工具，但由于目前暫無(wú)公認(rèn)的APTT混合糾正試驗(yàn)檢測(cè)方法和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)何時(shí)需運(yùn)用APTT混合糾正試驗(yàn)也無(wú)共識(shí)，因此目前仍有許多醫(yī)院未開(kāi)展此檢測(cè)項(xiàng)目，導(dǎo)致臨床醫(yī)生對(duì)部分不明原因的APTT延長(zhǎng)結(jié)果判斷存在困惑。

目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)、Rosner指數(shù)法及50%點(diǎn)差值法對(duì)內(nèi)源性凝血因子缺陷、即時(shí)反應(yīng)抑制劑、延遲反應(yīng)抑制劑均有較高的鑒別敏感性。目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)可直接通過(guò)觀察曲線區(qū)分三者，簡(jiǎn)單、易判。

針對(duì)延遲反應(yīng)抑制劑的判斷，本研究采用混合比例50%血漿溫育前后差值＞10 s作為判斷閾值，而華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院在采用STAGO全自動(dòng)血凝分析系統(tǒng)（法國(guó)STAGO公司）時(shí)，以溫育1 h后延長(zhǎng)3 s作為判斷閾值，提示存在較大系統(tǒng)間差異，難以標(biāo)準(zhǔn)化。目測(cè)法作為定性判斷方法，對(duì)系統(tǒng)依賴(lài)性較小，更有助于APTT混合糾正試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化。

目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)采用凝血分析儀自動(dòng)按比例混合血漿進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)標(biāo)本需求量少，本研究只需125 μL患者血漿就可完成5點(diǎn)即時(shí)型糾正試驗(yàn)，而傳統(tǒng)APTT混合糾正試驗(yàn)標(biāo)本需求量較大。此外，Rosner指數(shù)法只用到50%的混合比例，當(dāng)APTT稍延長(zhǎng)，存在弱抑制劑時(shí)，50%混合比例可能會(huì)使抑制劑因被稀釋而消失，而多點(diǎn)稀釋功能可減弱此影響。

綜上所述，目測(cè)法APTT混合糾正試驗(yàn)可快速對(duì)APTT延長(zhǎng)的可能原因進(jìn)行初步鑒別，結(jié)果直觀，對(duì)操作要求較低，適用于不能隨時(shí)進(jìn)行凝血因子抑制劑、LA檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)室。