復合重金屬鉛和鎘脅迫對洋甘菊生理指標的影響

陶月，郭榮慧，范銘，吳恒梅，姜成

(佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯154007)

目前，土壤被重金屬污染的相關環境問題吸引了人們的注意力。隨著逐年增長的人口數量及迅速發展的經濟，我國必須要面對愈發嚴重的土壤環境的安全問題。據相關資料統計，我國近2×107hm2的耕地面積已受到重金屬污染，約占全國總耕地面積的20%，被重金屬污染的糧食每年可達1.2×104萬t，造成200億元的直接經濟損失。如何安全高效的把重金屬污染的土壤修復，是我們的首要任務。植物修復作為重金屬污染治理技術，因其成本低、對土壤安全、無污染等優勢，越來越受到人們的重視。尋找對重金屬污染耐受性較強的植物，是實現植物修復的前提條件，目前對重金屬研究多數集中在花卉和農作物上，尚鮮見研究復合重金屬對藥用植物影響的研究，洋甘菊提煉出的產物是比較流行的保健和藥物制品，具有緩解失眠、發炎等功效，具有一定經濟效益，研究洋甘菊在重金屬污染下的相關生理指標的變化，探索其是否具有較強的重金屬耐受性，對于篩選重金屬污染修復藥用植物具有重要意義，將為藥用植物應用于重金屬污染土壤修復奠定理論研究基礎。

1 研究材料與方法

1.1 試驗材料

洋甘菊種子由佳木斯大學科技園實驗中心提供，重金屬添加方式為硝酸鉛和氯化鎘。

1.2 試驗方法

將各濃度梯度的重金屬溶液與土壤充分混合，放置陰涼處處理30～50 d。選取飽滿的洋甘菊種子每盆50粒，均勻播入土壤中，6次重復，5個處理(添加復合重金屬鉛和鎘濃度依次為20-100、40-200、60-300、80-400、100 mg/kg-500 mg/kg)，置于光照培養室進行培養，每天適當補充水分[1]。第5 d測定種子的出苗率，60 d后測定過氧化物酶活性、脯氨酸含量等生理指標。

1.3 過氧化物酶活性的測定

取1g洋甘菊的葉片，將葉片剪碎，放置于研缽內，取5 mL磷酸緩沖溶液加入，研成勻漿，4000 r/min離心10 min。將離心所得的上清液轉入試管內保存于冷處，其余沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提取一次，量出合并上清液的總體積，備用保存于低溫處。將反應混合物取3 mL加入0.1 mL提取酶溶液至比色杯中，對照用反應混合物3 mL加入0.1 mL磷酸緩沖液至比色杯中。立即測OD470，10 min后重復測量，根據以下公式計算出相應的過氧化物酶的活性[2]。

過氧化物酶活性=(ΔD470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)(μ/g·min)

式中：W為樣品鮮重；t為反應時間；Vt為總體積；Vs為測定時吸取的體積。

1.4 脯氨酸含量的測定

秤取0.5 g洋甘菊幼苗清洗干凈放入比色管中，加入3%磺基水楊酸5 mL，蓋蓋浸提10 min(經常搖動)于沸水浴中，冷卻后，取干凈的比色管，過濾，即為洋甘菊脯氨酸的提取液。取2 mL提取液至于比色管內加入2 mL冰醋酸、3mL酸性茚三酮，加熱40 min于沸水浴中，溶液呈現紅顏色，以甲苯為對照，測OD520，根據脯氨酸含量的標準曲線，查出脯氨酸含量a。由脯氨酸含量計算公式即得出洋甘菊幼苗脯氨酸的含量[3]。

結果計算：

脯氨酸含量 =(a×Vt/Vs)/(W×106)×100%

式中：W為樣品鮮重；a為提取液中的脯氨酸濃度值，由標準曲線求得；Vt是總體積；Vs為測定時吸取體積。

1.5 數據分析

采用SPSS 22.0軟件統計分析，用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 出苗率

出苗率可以直觀反應種子的發芽情況，不同濃度的鉛和鎘脅迫下洋甘菊種子的萌發具有一定程度的影響[4]。由圖1可知，洋甘菊出苗率隨復合重金屬鉛和鎘處理濃度的增加呈現趨勢為先上升后下降，在復合重金屬鉛-鎘處理濃度是40 mg/L-200 mg/L時，洋甘菊出苗率達到54.43%，為最大值。表明復合重金屬鉛和鎘對洋甘菊出苗率表現為低促髙抑的作用，從出苗率反映出其對重金屬鉛和鎘脅迫的最大耐受濃度為40 mg/L-200 mg/L。

圖1 鉛鎘復合污染對洋甘菊出苗率的影響

2.2 鉛和鎘復合脅迫對洋甘菊幼苗過氧化物酶的影響

圖2 鉛鎘復合污染對洋甘菊幼苗過氧化物酶的含量的影響

過氧化物酶的作用主要是將過氧化氫水解，過氧化氫是氫催化酶催化的氧化還原反應中的細胞毒性物質，過氧化物酶體中存在氧化酶和過氧化氫酶，起保護細胞的作用[5]。復合重金屬鉛和鎘脅迫對洋甘菊幼苗過氧化物酶的含量的影響見圖2，可以發現隨著復合重金屬濃度增大，過氧化物酶的含量逐漸增大，與對照相比，各處理濃度的過氧化物酶含量均高于對照，且差異顯著(P<0.05)。

2.3 復合重金屬鉛和鎘脅迫對洋甘菊幼苗脯氨酸含量的影響

植物體內的脯氨酸含量在逆境條件下增加顯著，且能在一定范圍內反映出植物的抗逆性。因此通過對脯氨酸含量的測定可以用于抗旱育種的生理指標評價標準之一[6]。由圖3可知隨著復合重金屬濃度的增加，洋甘菊幼苗的脯氨酸含量逐漸增大，當復合重金屬鉛-鎘濃度高于60mg/kg-300mg/kg時，洋甘菊幼苗的脯氨酸含量顯著高于對照(CK)，分別升高了2.28倍、2.34倍、2.46倍(P<0.05)。說明復合重金屬污染增大洋甘菊幼苗植物組織抗旱能力。

圖3 單因素復合濃度污染對洋甘菊幼苗脯氨酸的含量的影響

3 討論

3.1 復合重金屬鉛和鎘對洋甘菊出苗率的影響

植物的出苗率能既能反映種子的質量和活力 ，也能反映植物對重金屬脅迫的抗性能力。陳順鈺[7]等人的研究表明Pb和Cd對種子發芽率無顯著的影響(P>0.05)，但對幼苗的生長有顯著的抑制作用(P<0.05)。李雨心[8]研究表明高濃度的重金屬污染容易對特定植物的發芽率產生抑制現象，并隨著脅迫濃度的增加抑制現象明顯。孫博文[9]等人的研究表明單一Pb、Cd處理時，對植物的發芽率、主根長均出現高濃度抑制。該試驗結果表明低濃度的復合重金屬脅迫對洋甘菊種子的出苗率無顯著影響，高濃度的復合重金屬脅迫對洋甘菊種子的出苗率抑制顯著。該結果與陳順鈺[7]等、李雨心[8]、孫博文[9]等的研究結果相似。另外從該試驗中也可看出，低濃度的復合重金屬Pb2+、Cd2+對種子出苗率有輕微的影響，但與CK相比差異不明顯，高濃度的復合重金屬脅迫具有較大的抑制作用，出現這種情況的原因是由于洋甘菊種子在復合重金屬Pb2+、Cd2+的脅迫下具有一定的耐受作用，從而在低濃度的復合重金屬脅迫下并不會出現明顯的毒害現象，但在高濃度脅迫下，毒害作用過大，從而使出苗率受到顯著抑制。

3.2 復合重金屬鉛和鎘對洋甘菊幼苗過氧化物酶含量的影響

朱紅霞[10]等人的研究表明隨著鎘脅迫的濃度升高，滲透調節物質和抗氧化酶活性呈現先升高后降低的趨勢。陳順鈺[7]等人研究表明隨重金屬脅迫時間延長POD活性顯著升高。余國源[11]研究表明重金屬脅迫下傘房決明的生長受到輕微抑制，POD活性上升。該試驗結果表明在復合重金屬脅迫下，洋甘菊幼苗過氧化物酶的含量隨重金屬濃度增高逐漸增加。該試驗結果與朱紅霞等[10]、陳順鈺等[7]和余國源[11]的研究結果相似。本研究還發現相同復合重金屬濃度脅迫下過氧化物酶含量會隨時間的增加而增加，當復合重金屬濃度超過一定闕值時，植物將出現毒害甚至死亡的現象。

3.3 復合重金屬鉛和鎘對洋甘菊幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸在植物體內不僅是理想的調節滲透物質，還是膜和酶的自由基清除劑，從而在滲透脅迫下對植物的生長起一定的保護作用，在逆境條件下含量增加顯著，且能在一定程度上反映出植物的抗逆性。高秉婷[12]等研究表明，Zn2+脅迫會對脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性產生顯著影響。蔡雄偉[13]研究表明鉛脅迫能使狗牙根葉中游離的脯氨酸含量增多。該試驗結果表明在復合重金屬鉛和鎘脅迫下，洋甘菊幼苗脯氨酸的含量隨濃度升高而增大，與高秉婷[12]、蔡雄偉[13]研究結果相似。由于植物組織的抗逆性具有一定的闕值，當受害程度超出闕值范圍，則植物出現受損、停止生長甚至死亡的現象。

4 結論

多數生理生化指標均與植物抗重金屬污染的能力有關，采用盆栽試驗研究復合重金屬鉛和鎘脅迫對洋甘菊幼苗的影響，洋甘菊幼苗過氧化物酶含量及脯氨酸含量均隨復合重金屬脅迫濃度的增高而增多，但洋甘菊的出苗率表現為低濃度影響不顯著，高濃度抑制。結果表明復合重金屬鉛和鎘脅迫對洋甘菊種子萌發產生一定的毒害作用。可能是通過抑制種子中的淀粉酶、蛋白酶的活性進而影響洋甘菊種子的新陳代謝，降低營養利用的能力而產生的。本研究為復合重金屬脅迫對藥用植物的生理指標的影響提供有價值的理論依據。