GC-MS方法分析新鮮碧桃花揮發油及β-葡萄糖苷酶對碧桃花的增香和抗菌作用

史博文,劉錚錚,劉語,宋寧*

(1.西安國際醫學中心麻醉手術中心,西安710075；2.西安交通大學藥學院，西安710061)

碧桃(AmygdaluspersicaLinn. var.persicaf.duplexRehd.)屬薔薇科落葉小喬木，是優良的觀賞樹種之一，深受人們和園藝工作者的青睞。碧桃花，又名千葉桃花，是桃的變種，常見品種有白花碧桃、紅花碧桃、垂枝碧桃、撒金碧桃等。《詩經》有載：“桃之夭夭，灼灼其華”。碧桃在中國已有3000多年的栽培歷史，現在全國各地廣泛栽培，主產于西北、華北、華東、西南等地區[1]。碧桃除具有較高的園林綠化價值外，它的食用、藥用價值也為人類創造了許多財富。碧桃樹干上汁液結膠形成的塊狀物俗稱桃膠，不僅可食用，而且具有養陰生津，清瀉虛熱的作用[2]；其未成熟的果實稱為碧桃干或桃奴，有收斂止汗之功[2]，還可治療兒童營養性貧血[3]；由碧桃為主藥組成的碧桃咳喘飲可防治急慢性支氣管炎[4]。

目前，對碧桃的研究主要集中在栽培種植上[5-6]，對其化學成分和抗菌活性研究鮮有報道。同時，植物揮發油作為植物重要的次生代謝物質之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、安全等特點[7-9]，在醫學、食品、香料、化妝品等方面具有廣闊的應用前景。因此，本實驗采用揮發油提取器法提取新鮮碧桃花中揮發油，并通過氣相色譜-質譜聯用方法進行成分分析，采用抗菌實驗評價其體外抑菌活性，為進一步開發利用碧桃花揮發油提供理論依據。

β-葡萄糖苷酶是能夠水解芳香基或烷基葡萄糖甙或纖維二糖的糖苷鍵的一類酶[10]，能將鮮花中如糖苷類等本身無香味、不揮發的物質水解，釋放出潛在的香氣成分，產生濃郁的具有天然特征香味的物質，起到自然增香的作用[11-12]。

本實驗通過比較加入β-葡萄糖苷酶前后新鮮碧桃花揮發油化學成分變化研究β-葡萄糖苷酶對其增香作用，同時通過抗菌實驗評價β-葡萄糖苷酶對其抑菌作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：新鮮碧桃花于2019年3月采自西安交通大學藥學院的藥園，由西安交通大學藥學院牛曉峰教授鑒定為薔薇科植物碧桃(AmygdaluspersicaLinn. var.persicaf.duplexRehd.)的花(黃色花)；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌，以上菌種由西安交通大學醫學部微生物教研室提供。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；超凈工作臺(美國Thermo公司)；恒溫培養箱(美國Thermo公司)；立式高壓滅菌器(上海申安醫療器械廠)。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純)；無水硫酸鈉(西安化學試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠，分析純)；檸檬酸(成都化學試劑廠，分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應。分別稱取兩份200 g新鮮碧桃花于250 mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中一份加0.5 g β-葡萄糖苷酶，另一份為空白對照。同時置于搖床中50 ℃恒溫水浴5 h。

1.2.2 揮發油的提取。將β-葡萄糖苷酶水解前后的碧桃花分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加水800 mL，沸石數粒，搖勻，按2015版《中國藥典(四部)》揮發油測定法(通則2204甲法)提取揮發油，保持微沸5 h。收集所得揮發油，加入少量無水硫酸鈉，靜置。稱取揮發油適量置于10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，待測(用于GC-MS分析)。稱取新鮮碧桃花揮發油適量，臨用前用無菌蒸餾水配成2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016 mg/mL溶液(用于抗菌試驗)，未加β-葡萄糖苷酶處理所提取的碧桃花揮發油為揮發油(1)，加β-葡萄糖苷酶處理后提取的碧桃花揮發油為揮發油(2)。

1.2.3 氣相色譜-質譜條件

1.2.3.1 氣相條件：色譜柱為SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣；進樣口溫度為250 ℃；分流比為5∶1；流速為1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，以2 ℃/min速率升到120 ℃，再以3 ℃/min速率升到210 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；進樣量：1 μL。

1.2.3.2 質譜條件：接口溫度：250 ℃；離子源：EI；離子源電壓：60 ev；離子源溫度：230 ℃；質量掃描范圍：45～550 m/z；溶劑峰切除時間：2.5 min，質譜檢測起測時間：3.0 min。

1.2.4 最小抑菌濃度的測定。采用瓊脂平板稀釋法計算最低抑菌濃度(MIC)[13-14]。以環丙沙星為對照，將環丙沙星和碧桃花揮發油用無菌蒸餾水進行倍比稀釋，制備系列濃度稀釋液，然后用無菌吸管將稀釋液分別定量加入到無菌培養皿中，與定量加入的培養基充分混勻，靜置凝固后，制成含樣品平板，按皿底的記號，在以上培養基上分別接種傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，移入培養箱中35～37 ℃培養24 h，觀察細菌生長情況；另取一個稀釋系列，不接種任何菌種作為對照，以完全沒有菌生長的最低濃度作為碧桃花揮發油的最低抑菌濃度(MIC)。計算最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 數據處理。所得的色譜和質譜信息經數據處理系統與其內存譜庫(NIST)自動檢索和解析，并用峰面積歸一法測定了各化學成分在揮發油中的相對百分含量。抗菌實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，顯著性差異水平為0.05。

2 結果

2.1 新鮮碧桃花中揮發油成分分析

經GC-MS分析測得新鮮碧桃花中揮發油提取物的總離子流圖如圖1和圖2所示。

圖1 新鮮碧桃花揮發油的GC-MS總離子流圖(無酶)

采用NIST標準質譜圖數據庫進行綜合對比分析，由色譜峰面積歸一化法計算各化學成分的質量分數，共鑒定出32種主要的揮發性化學成分，分析結果見表1。

注：*代表加β-葡萄糖苷酶組

由表1可知，新鮮碧桃花在分析鑒定出32種揮發性化學成分，主要有醇類(5種，占2.53%)，烯類(1種，占0.57%)，烷烴類(8種，占6.76%)，酚類(4種，占7.7%)，醛類(6種，占49.91%)，酮類(2種，占13.33%)，酯類(3種，占17.74%)，醚類(1種，占0.23%)芳烴類(1種，占1.02%)和酸類(1種，占0.21%)10類化合物。其中，醛類、酮類和酯類化合物相對含量較高，其主要成分為苯甲醛(48.92%)，苯甲酸芐酯(12.79%)，植酮(6.89%)，2-羥基-5-甲基苯乙酮(6.44%)，乙酸芐酯(4.68%)。醚類和酸類化合物含量較低。

通過表1的對比可知，在新鮮碧桃花中加入β-葡萄糖苷酶后香氣成分的含量顯著增加。加入β-葡萄糖苷酶后新增了2種化合物，分別為(-)-冰片和2,4-癸二烯醛，減少了1種化合物，為4-叔丁基-2,6-二異丙基苯酚。同時，反式-2,4-癸二烯醛、壬醛、苯甲酸乙酯、乙酸芐酯等化合物含量均增加，相對含量分別增加7.04%、0.24%、0.16%、2.57%，增長率達到4141.76%、137.40%、58.15%和54.86%，而苯甲酸芐酯、丁香酚、苯甲酸等化合物含量相對減少。

天然香料來自于動植物，但以植物為主。有研究表明[15]，香味成分與葡萄糖等結合成糖苷后，不具揮發性或揮發性很低，酶和化學方法分解這些糖苷能增加精油產量，對香氣的形成起著重要的作用。碧桃花中許多化學成分可用作香料，在食品、化妝品、化工等行業應用廣泛。冰片是龍腦香科植物龍腦香的樹脂和揮發油加工品提取獲得的結晶，廣泛用于配制迷迭香、熏衣草型香精，并用于中藥和中國墨中。丁香酚天然存在于丁香油、丁香羅勒油以及肉桂油等精油中，具有強烈的丁香香氣和辛香香氣，是調配香石竹花香的體香，用入有色香皂加香，也可用于辛香、木香和東方型、薰香型中，還可用于食用的辛香型、薄荷、堅果、各種果香、棗子香等香精及煙草香精中。反式-2,4-癸二烯醛GB 2760-1996規定為允許使用的香料，主要用于配制雞肉香精及土豆片、柑橘、油炸品和香辛型食品。壬醛GB 2760-1996規定為暫時允許使用的食用香料，主要用于配制橙子、檸檬和白檸檬等型香精，用量極微。苯甲酸乙酯常用于配制香水香精和人造精油，也可用作食用香料。乙酸芐酯常用于配制茉莉型等花香香精和皂用香精。

加入β-葡萄糖苷酶后碧桃花中反式-2,4-癸二烯醛、壬醛、苯甲酸乙酯、乙酸芐酯等香精類成分含量大幅增加，同時新增了(-)-冰片和2,4-癸二烯醛2種化合物，說明β-葡萄糖苷酶可水解碧桃花香氣前體物質，釋放出碧桃花中潛在香氣成分，對碧桃花有一定的增香作用。

2.2 抗菌實驗結果

新鮮碧桃花揮發油對傷寒沙門氏菌等4種供試細菌的抑制實驗結果如表2所示。

表2 新鮮碧桃花揮發油抗菌實驗MIC值(mg·mL-1,n=3 )

由表2可知，新鮮碧桃花揮發油對傷寒沙門氏菌等4種供試菌具有明顯抑制作用。揮發油(1)和揮發油(2)進行比較，揮發油(2)仍具有一定增加抗菌作用。說明經過β-葡萄糖苷酶處理后再提取的揮發油抗菌活性不變。

3 結論

通過建立碧桃花揮發油的GC-MS方法，共鑒定出32種揮發性化學成分，其揮發油的化學成分主要以醛、酮、酯類化合物為主。加入β-葡萄糖苷酶后反式-2,4-癸二烯醛等香精類化學成分含量大幅增加，說明β-葡萄糖苷酶能釋放出碧桃花中潛在香氣成分，對碧桃花有一定的增香作用，同時抗菌實驗結果表明β-葡萄糖苷酶不改變其抗菌活性，為進一步開發和利用碧桃花資源提供了理論依據。