白藜蘆醇對胰島素抵抗小鼠糖脂代謝的影響及心肌的保護作用

魏 葉， 朱心瑤， 王 坤， 王志榮

(1.徐州醫科大學第一臨床學院，徐州 221004;2.徐州醫科大學附屬醫院心內科，徐州 221004)

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)即機體靶器官對胰島素的敏感性降低、胰島素利用障礙，不能發揮正常生物學效應，并導致胰島β細胞代償性的分泌胰島素水平升高，繼而出現高胰島素血癥。IR發生后常可導致一系列的糖脂代謝紊亂，靶器官也出現相應的變化。高脂飲食容易導致肥胖、誘發IR，而白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種天然的多酚類抗氧化劑，存在于葡萄，漿果，花生和一些蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[1-3]。研究表明RES是一種核轉錄因子PPARγ(過氧化物酶增殖物激活受體γ)(peroxisome proliferator-activated receptors γ)的激動劑[4]。基于此，觀察RES對IR小鼠的糖脂代謝的影響及通過激動PPARγ改變心肌的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高脂飼料D12492、對照組飼料D12450B(Research Diets 公司，美國)；RES(Sigma公司，美國)含量>98%；羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium，CMC)(Sigma公司，美國)； 兔抗小鼠PPARγ、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、脂聯素(adiponectin，ADPN)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗、均購自武漢三鷹生物技術有限公司； 羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：A030-2-1)；SuperReal熒光定量預混試劑增強版(天根生化科技北京有限公司，Lot S7104)、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技北京有限公司，批號：Lot R7026)。

1.2 試驗分組及動物模型的建立

SPF級6 周齡C57BL/6J小鼠40只，雄性，體重 17～19 g，健康，購自濟南朋悅試驗動物繁育有限公司[許可證號為 SCXK(魯)2014-0007]；隨機分對照組(NC)、高脂組(H)、高脂+CMC組(C)和高脂++CMC+RES組(R),每組10只。NC組以D12450B飼料飼養，另外三組以D12492高脂飼料飼養，每周測量體重。14周后，禁食16 h，剪尾采血行葡萄糖耐量試驗(glucose tolerance test，GTT)試驗。

1.3 灌胃干預

RES溶于0.5%CMC中制成混懸液，R組以22.5 mg/(kg·d)的RES灌胃處理，C組以等體積CMC灌胃，每日一次，繼續飼養8周，小鼠處死前一周分別進行GTT試驗和胰島素耐量試驗(insulin tolerance test，ITT)試驗。

1.4 試驗取材

禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球取血后脫頸處死，開胸剪取心臟組織迅速置于預冷的磷酸鹽緩沖液中沖洗，濾紙吸干，稱心臟濕重。部分心臟組織置于液氮速凍后，-80 ℃保存備用。測量脛骨長度。

1.5 血清指標檢測

取血后，全血4 ℃靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，取血清備用。血清送至徐州醫科大學附屬醫院全自動生化分析儀檢測血脂、血糖。采用Merck Milliproe 液相芯片試劑盒，按照試劑盒操作步驟檢測胰島素、瘦素、抵抗素、脂聯素。

1.6 心肌指標檢測

取左心室心肌依照羥脯氨酸測試盒說明書操作檢測羥脯氨酸。western-blot(WB)方法檢測心肌PPARγ、TNF-α、ADPN、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的蛋白水平以及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測PPARγ、TNF-α、ADPN、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-Myosin heavy chain，β-MHC)的mRNA,引物序列如表1所示。

表1 各基因的引物序列Table 1 Primer sequences of gene

1.7 統計方法

2 試驗結果

2.1 動物存活及模型情況

小鼠喂養14周行GTT試驗，以對照組GTT試驗結果平均曲下面積(area under the curve，AUC)為基準，剔除三組高脂組中AUC低于對照組平均值的小鼠。H組2只，C組3只，R組1只。灌胃干預7周行ITT試驗。

2.2 各組小鼠一般情況

2.2.1 小鼠的體重變化

RES干預后，與NC組相比，H及C組體重仍呈升高趨勢，而R組趨勢明顯減緩，如圖1(a)所示。試驗結束時，H及C組體重與NC組相比P<0.01；R組較H減輕，P<0.01,如圖1(b)所示。

2.2.2 各組小鼠的一般情況

高脂喂養的三組小鼠全心重量(heat weight,HW)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹胰島素(fasting insulin，FIN)水平及胰島素抵抗指數(HOMA-IR)均高于NC組，但胰島素水平差異無統計學意義。R組的體重及空腹血糖水平明顯改善，HW(P<0.01)、FBG(P<0.05)，如表2所示。

注：與NC組比較，**表示P<0.01；與H組比較,##表示P<0.01。下同。圖1 小鼠體重變化Fig.1 Changes of mice weight

表2 各組小鼠的一般情況Table 2 General conditions of mice in each

注：HOMA-IR=(FBG×FIN)/22.5；與NC組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01; 與HDF組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。下同。

2.3 RES對糖脂代謝的影響

2.3.1 RES對糖耐量及胰島素耐量的影響

小鼠灌胃7周左右分別行GTT試驗及ITT試驗。高脂飼養的三組小鼠均出現糖耐量受損，而R組GTT及ITT試驗曲下面積明顯低于H及C組，P<0.01，圖2所示。

圖2 ITT及GTT試驗結果Fig.2 The results of ITT and GTT

2.3.2 血清血脂及血糖情況

高脂飼養H及C組小鼠的血糖、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)均高于NC組，P<0.01；而RES干預8周后減輕了該趨勢，P<0.05。而甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的變化無統計學意義,如表3所示。

表3 各組小鼠的血脂情況Table 3 Blood lipids of mice in each

2.3.3 血清激素變化情況

與NC組相比，小鼠血清中瘦素、抵抗素在H及C組均升高趨勢，而與H組相比，RES干預后兩種激素的血清水平呈下降趨勢，但無統計學意義。而ADPN血清水平無明顯變化，如表4所示。

表4 小鼠血清中脂肪因子變化情況Table 4 Changes of adipokine in serum of mice

2.4 小鼠心肌變化

2.4.1 心臟重量/脛骨長度比

與NC組小鼠比較，H和C組小鼠的心臟重量/脛骨長度比值明顯升高，而RES干預后較H組明顯下降，P<0.01，如圖3所示。

與H組比較，##表示P<0.01。下同。圖3 小鼠心臟重量/脛骨長度比Fig.3 Heart weight/Tibial length ratio in mice

2.4.2 心肌中ANP、BNP、β-MHC的mRNA的表達

H組與C組的ANP、BNP、β-MHC的mRNA的表達水平明顯高于NC組；而在R組小鼠心肌中的表達水平呈下降趨勢，P<0.01或P<0.05，如圖4所示。

圖4 心肌中ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達Fig.4 The mRNA of ANP,BNP and β-MHC in myocardium

2.4.3 心肌中羥脯氨酸含量

按羥脯氨酸測試盒說明書操作測定心肌中羥脯氨酸含量，H及C組小鼠每克心肌組織中羥脯氨酸含量均高于NC組，P<0.01；R組單位心肌的羥脯氨酸含量也高于NC組，P<0.05,但較另兩組明顯下降，P<0.05，如圖5所示。

圖5 心肌中羥脯氨酸含量Fig.5 The content of hydroxyProline in myocardium

2.4.4 心肌中的膠原蛋白表達

與NC組比較，H與C組小鼠心肌中Ⅰ型膠原(collagenI)、Ⅲ型膠原(collagenⅢ)蛋白表達水平均升高，P<0.01,且R組膠原水平均呈下降趨勢，見圖6(a)～圖6(c)。

圖6 心肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原的蛋白條帶及蛋白表達Fig.6 Protein bands and expression of CollagenI,CollagenⅢ in myocardium

2.4.5 心肌中PPARγ、TNF-α、ADPN的mRNA及蛋白表達

PCR及WB方法檢測心肌中相關基因的mRNA與蛋白的表達水平。與NC組相比，PPARγ、ADPN的mRNA水平在H及C組均降低，TNF-α則在H及C組明顯升高，P<0.01或P<0.05，如圖7所示。而與H組相比，R組的PPARγ、ADPN的mRNA水平升高，TNF-α降低。同時蛋白表達水平呈相同趨勢，如圖8所示。

圖7 心肌中PPARγ、ADPN和TNF-α 的mRNA表達Fig.7 The mRNA of PPARγ,ADPN and TNF-α in myocardium

圖8 心肌中PPARγ、ADPN和TNF-α的蛋白條帶及蛋白表達Fig.8 Protein bands and expression of PPARγ,ADPN and TNF-α in myocardium

3 分析及討論

RES 是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于水果、葡萄酒、虎杖等植物中的一種多酚類物質，因“法國悖論”現象引起關注，可抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化等發揮心血管保護作用。前期已證實RES可以抑制心房重構、減輕心房纖維化、減輕房顫氧化應激損傷等[5-7]。有研究表明RES是一種PPARγ的激動劑[4]，當干預劑量為22.5 mg/(kg·d)時，降低小鼠血脂的作用最為明顯[8]，故RES的干預劑量定為22.5 mg/(kg·d)。試驗中，小鼠經高脂飼養14周后GTT與ITT試驗后測得的AUC較對照組明顯升高，且HOMA-IR也明顯升高、均>2.5,提示小鼠達到IR標準。

3.1 RES影響IR小鼠糖脂代謝

研究發現，高脂飼養的小鼠出現體重增加、TC及LDL水平明顯升高，TG的血清水平也呈升高的趨勢。同時血清中胰島素、瘦素、抵抗素的水平也有所升高，但差異無統計學意義。而RES干預后血清中的血脂及脂肪因子升高水平均有所緩解。另外，R組GTT及ITT試驗的AUC呈下降的趨勢，且FBG水平明顯降低，表明RES可以改善IR小鼠的糖脂代謝紊亂。

3.2 RES對IR小鼠心肌的保護作用

研究發現高脂飼養的小鼠心肌組織中BNP、ANP、β-MHC的mRNA水平明顯升高，且心臟重量/脛骨長度比值升高，提示IR小鼠存在心肌肥厚的表現。羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分之一，其含量反映了膠原組織含量及纖維化程度，經檢測高脂飼養小鼠的羥脯氨酸水平升高，且WB檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的蛋白表達明顯升高，表明IR小鼠心肌出現了纖維化表現。RES干預后心肌纖維化水平有所減輕。

3.3 RES對IR的心肌作用的機制探討

PPARγ是一類核轉錄因子，在多在脂肪組織中表達，但在心肌組織中也有少量表達。它在體內與視黃醇類X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體，結合于靶基因啟動子的PPAR反應元件(PPREs)調控靶基因的轉錄[9]。噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)藥物在糖尿病治療中通過激動PPARγ增強外周組織的胰島素敏感性，改善IR，如吡格列酮、羅格列酮等。但此類藥物常導致體重增加，水腫，心衰等副作用。研究中，IR小鼠出現PPARγ的mRNA及蛋白表達水平明顯降低，同時激活了炎癥因子TNF-α的表達，而ADPN的表達水平下降。但RES干預后該趨勢明顯改善。RES作為PPARγ的激動劑，在高脂飼養IR小鼠心肌組織中激活PPARγ,使其與RXR形成異二聚體作用于TNF-α的PPREs上抑制TNF-α的轉錄，從而減輕了TNF-α對ADPN的抑制作用，使心肌組織的ADPN表達水平升高。Iwaki等[10]發現ADPN的啟動子中含有PPRE的位點，PPARγ激活劑能誘導ADPN的啟動子，使其活性升高5～10倍。PPARγ激活劑通過增強ADPN mRNA的穩定性，促進ADPN蛋白的合成、釋放，降低組織TNF-α水平，減輕TNF-α介導的對ADPN表達的抑制作用[11]。研究表明ADPN與IR所致的心室重構關系密切，給予外源ADPN可以減輕IR，進而改善心室重構[12]。推測低水平 ADPN誘發心室重塑的機制可能是：①ADPN水平降低，引起炎癥因子因子TNF-α釋放增加，加重IR的程度;②低水平ADPN可以通過抑制AMPK信號通路促進活性氧(reactive oxygen sepcies，ROS)誘導的心室重構[13]；③ADPN水平降低時，使外周血管緊張素激活，增加心臟負荷，進而促進心肌細胞的肥厚與增殖[14]。 因此，RES可能是通過激動PPARγ，調節炎癥因子TNF-α、脂肪因子ADPN水平以及兩者之間的相互作用，減輕了心肌肥厚及纖維化改變。研究結果為RES應用于治療IR引起的機體代謝紊亂提供了更多科學依據，也為RES在預防糖尿病心肌病的發生方面提供了理論支持。

4 結論

高脂飲食可以誘導小鼠產生胰島素抵抗，導致小鼠糖脂代謝紊亂。RES對胰島素抵抗小鼠的糖脂代謝紊亂有調節作用，并且可以減輕胰島素抵抗小鼠的心肌肥厚及纖維化，具有心肌保護作用。這種心肌保護左右有可能是通過激動PPARγ調節ADPN、TNF-α來實現的。