封聰，殷晨暉，金維緣，王思映，張巍偉，姜泓

中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，沈陽110122

胃腸積熱證屬于中醫(yī)陽明病熱證范疇[1]，主要由膳食結(jié)構(gòu)不平衡所致，其中喜食肥甘厚味、辛辣燥烈之品等是引起積熱內(nèi)蘊的主導(dǎo)因素。隨著社會的不斷發(fā)展，飲食結(jié)構(gòu)的變化和生活節(jié)奏的加快，胃腸積熱成為臨床常見證型，尤其是兒童、青少年及青年女性。中醫(yī)動物模型的確立是中醫(yī)藥經(jīng)典理論研究、藥效學(xué)評價的前提條件，是現(xiàn)代中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]。因此，建立胃腸積熱證動物模型成為目前亟待解決的問題。已有研究結(jié)果表明，以積熱飼料喂食大鼠可建立胃腸積熱證動物模型，但大便干結(jié)不明顯；洛哌丁胺是一種常見的止瀉藥，用以聯(lián)合建模或可導(dǎo)致大便干結(jié)，使模型更符合胃腸積熱證候特點。2018年12月～2019年4月，我們采用三因素三水平正交設(shè)計的方法，以積熱飼料喂食時間、洛哌丁胺給藥劑量、洛哌丁胺給藥時間為主要因素，以舌色、糞便性狀、尿液顏色、腸鳴音、冷熱趨向性、體溫的宏觀表征作為考察指標(biāo)，優(yōu)化胃腸積熱證大鼠模型的實驗條件并加以驗證，以期為中醫(yī)藥治療胃腸積熱證提供良好的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 實驗動物：健康SPF級雌性SD大鼠80只，3周齡，體質(zhì)量50～60 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK(遼)2013-0001。主要儀器：ZH-6C型智能冷熱板測痛儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，家用、醫(yī)用兩用聽診器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，動物舌相數(shù)字化診療系統(tǒng)(實驗室自制)，大鼠代謝籠(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，BAT-12微探針溫度計(美國Physitemp公司)。主要試劑：全脂甜奶粉(黑龍江紅星集團(tuán)食品有限公司)，炭烤馬面魚片(臺州石塘小漁村電子商務(wù)有限公司)，小麥粉[中糧面業(yè)營銷管理(北京)有限公司]，純豆粉(南方黑芝麻集團(tuán)股份有限公司)，將魚片、全脂甜奶粉、小麥粉、純豆粉按1∶1∶1∶2制成積熱飼料[3，4]；異氟烷(一品制藥)，洛哌丁胺膠囊(生產(chǎn)批號601R01，上海朝暉藥業(yè)有限公司)。

1.2 胃腸積熱證大鼠模型實驗條件的優(yōu)化

1.2.1 動物分組與造模條件 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，取60只大鼠隨機分為10組，每組6只。第1～9組用于胃腸積熱證模型三因素三水平正交設(shè)計實驗，積熱飼料喂食時間(A)分別為4、8、12周，洛哌丁胺灌胃劑量(B)分別為3、6、12 mg/kg(以生理鹽水為混懸介質(zhì))，洛哌丁胺灌胃時間(C)分別為實驗結(jié)束前5、10、15 d，正交試驗安排見表1。每周記錄大鼠體質(zhì)量2次，調(diào)節(jié)灌胃劑量。第10組作為對照組，正常飼料飼養(yǎng)，生理鹽水灌胃。另外20只大鼠用于正交設(shè)計實驗的驗證實驗。整個實驗過程中使用專用籠具、專用墊料，自由攝食、飲水，室溫保持20～25 ℃，相對濕度控制在40%～70%，保證光照12 h/d，晝夜循環(huán)飼養(yǎng)。實驗過程完全遵循實驗倫理學(xué)要求，盡量減少動物的使用量，并最低限度減少動物痛苦。

表1 胃腸積熱證大鼠模型正交試驗安排

注：A為積熱飼料喂食時間，1、2、3分別為4周、8周、12周；B為洛哌丁胺灌胃時間，1、2、3分別為實驗結(jié)束前5 d、10 d、15 d；C為洛哌丁胺灌胃劑量，1、2、3分別為3 mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg；D為空白因素，1、2、3均相等。

1.2.2 胃腸積熱證大鼠模型的宏觀表征指標(biāo)觀察 分別在首次給予洛哌丁胺前及末次給藥24 h后，依據(jù)文獻(xiàn)和《大鼠/小鼠辨證論治實驗方法學(xué)》，從胃腸積熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)中選取舌色、尿液顏色、糞便性狀、腸鳴音、冷熱趨向性、體溫等作為宏觀表征觀察指標(biāo)。

1.2.2.1 舌色 大鼠麻醉后，采用舌相照相分析系統(tǒng)拍攝大鼠舌面，記錄紅色、綠色、藍(lán)色像素值[5]，綜合評價舌體顏色變化。

1.2.2.2 尿液顏色 收集大鼠尿液4 h，精密吸取0.5 mL，置于96孔板中；于足夠光照強度的固定光源下，以空白濾紙為背景，拍攝照片；用Photoshop圖片處理軟件，記錄藍(lán)色像素值，像素值越低則尿液顏色黃色程度越重。

1.2.2.3 糞便性狀 采用布里斯托大便性狀量表對大鼠糞便性狀量化評分，如評分不同則重新評分[6]。評分越低糞質(zhì)越軟，越高則糞質(zhì)越硬。

1.2.2.4 腸鳴音 大鼠麻醉后，用聽診器計數(shù)大鼠5 min內(nèi)的腸鳴音次數(shù)，次數(shù)減少為腸蠕動下降。

1.2.2.5 冷熱趨向性 訓(xùn)練階段：冷熱板溫度為室溫(25 ℃)，訓(xùn)練3 d，1次/d，每次3 min。測定階段：觀察大鼠5 min內(nèi)在低溫板(15 ℃)和高溫板(40 ℃)停留的時間[7]，判定其冷熱趨向性。

1.2.2.6 體溫 將大鼠體溫計探頭插入大鼠肛門，測定直腸溫度。

1.3 胃腸積熱證大鼠模型的宏觀表征指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分配 按宏觀表征中舌相(紅、綠、藍(lán))、尿色、糞便、腸鳴音、冷板趨向性、直腸溫度的權(quán)重系數(shù)依次為3(1∶1∶1)∶1∶3∶3∶3∶3，綜合評分總分16分。將各項指標(biāo)的最終得分進(jìn)行加和，為該組動物模型的最終得分。

1.4 胃腸積熱證大鼠模型實驗條件優(yōu)化后的驗證 將用于驗證實驗的20只大鼠隨機分為兩組各10只，模型組采用優(yōu)化后的實驗條件制作胃腸積熱證大鼠模型，對照組常規(guī)飼養(yǎng)、生理鹽水灌胃。按照1.2.2的方法觀察各項宏觀表征指標(biāo)，判定是否符合胃腸積熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。

2 結(jié)果

2.1 不同胃腸積熱條件下各組大鼠宏觀表征比較

2.1.1 各組大鼠舌色比較 給予洛哌丁胺前，與對照組比較，第1～9組大鼠舌色中三種顏色像素值升高，第4、5、6組大鼠舌色中綠色和藍(lán)色像素值升高(P均<0.05)；給予洛哌丁胺后，第9組大鼠舌色中紅色像素值降低(P<0.05)，第1～6組大鼠舌色中三種色像素值升高而第7、8組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

注：A、B、C分別為給予洛哌丁胺前舌色的紅色、綠色、藍(lán)色像素值變化；D、E、F分別為給予洛哌丁胺后舌色的紅色、綠色、藍(lán)色像素值變化；與對照組比較，*P<0.05。

2.1.2 各組大鼠尿液顏色比較 給予洛哌丁胺前，與對照組比較，第1～9組大鼠尿液藍(lán)色像素值降低，第1～5組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；給予洛哌丁胺后，第2、3組大鼠尿液藍(lán)色像素值降低(P均<0.05)，第9組大鼠尿液藍(lán)色像素值升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

2.1.3 各組大鼠糞便性狀評分比較 給予洛哌丁胺前，與對照組比較，第1～9組大鼠糞便性狀評分下降，第1組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給予洛哌丁胺后，各組大鼠糞便變硬，第3、6、9組糞便性狀評分升高(P均<0.05)。見圖3。

2.1.4 各組大鼠腸鳴音次數(shù)比較 給予洛哌丁胺前，與對照組比較，除第3組外，其余各組腸鳴音次數(shù)減少(P均<0.05)；給予洛哌丁胺后，除第4、6組外，其余組腸鳴音次數(shù)減少(P均<0.05)。見圖4。

注：A為給予洛哌丁胺前尿液顏色中藍(lán)色像素值變化；B為給予洛哌丁胺后尿液顏色中藍(lán)色像素值變化；與對照組比較，*P<0.05。

注：A為給予洛哌丁胺前糞便性狀評分變化；B為給予洛哌丁胺后糞便性狀評分變化；與對照組比較，*P<0.05。

注：A為給予洛哌丁胺前腸鳴音次數(shù)變化；B為給予洛哌丁胺后腸鳴音次數(shù)變化；與對照組比較，*P<0.05。

2.1.5 各組大鼠冷熱板趨向性比較 給予洛哌丁胺前，與對照組比較，第4～6組大鼠在低溫區(qū)域停留時間有增加趨勢，其中第5組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；洛哌丁胺干預(yù)后，第2～9組大鼠在低溫區(qū)域停留時間增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖5。

注：A為給予洛哌丁胺前在低溫區(qū)域停留時間變化；B為給予洛哌丁胺后在低溫區(qū)域停留時間變化；與對照組比較，*P<0.05。

2.1.6 各組大鼠體溫比較 給予洛哌丁胺前，與對照組比較，第4～6組大鼠直腸溫度升高，第7～9組差異有統(tǒng)計學(xué)意義；給予洛哌丁胺后，第3、7組大鼠直腸溫度升高(P均<0.05)。見圖6。

注：A為給予洛哌丁胺前直腸溫度變化；B為給予洛哌丁胺后直腸溫度變化；與對照組比較，*P<0.05。

2.2 胃腸積熱證大鼠模型實驗條件優(yōu)化的正交設(shè)計實驗結(jié)果 三種因素對綜合評分影響強弱依次為洛哌丁胺灌胃時間(R=3.36)、洛哌丁胺灌胃劑量(R=1.54)、積熱飼料喂食時間(R=1.49)，積熱飼料喂食時間中8周(K2=11.95)﹥12周(K3=11.05)﹥4周(K1=10.45)，洛哌丁胺灌胃劑量中12 mg/kg(K3=13.20)﹥6 mg/kg(K2=10.42)﹥3 mg/kg(K1=9.84)，洛哌丁胺灌胃時間10 d(K2=12.12)﹥5 d(K1=10.75)﹥15 d(K3=10.58)。因此，胃腸積熱證大鼠模型最優(yōu)實驗條件為積熱飼料喂食時間8周、洛哌丁胺灌胃劑量12 mg/kg、洛哌丁胺灌胃時間10 d。見表2。

表2 腸積熱證大鼠模型實驗條件優(yōu)化的正交設(shè)計實驗結(jié)果

2.3 胃腸積熱證大鼠模型實驗條件優(yōu)化后的驗證結(jié)果 與對照組比較，模型組大鼠舌色中紅色、綠色、藍(lán)色像素值降低，尿液中藍(lán)色像素值降低，糞便性狀評分升高，腸鳴音次數(shù)減少，在低溫區(qū)域停留時間延長，直腸溫度升高(P均<0.05)，完全符合胃腸積熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)。見表3。

表3 模型組和對照組大鼠宏觀表征比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

胃腸積熱證是因無形熱邪或有形熱結(jié)所致的胃腸陽熱偏盛狀態(tài)[9]，臨床主要表現(xiàn)為惡熱、易汗出、口臭、口渴喜涼飲、大便干結(jié)、小便黃、舌紅、苔黃厚、脈滑數(shù)等里熱實證。本證可見于各年齡段的患者，尤其多見于兒童及青少年，小兒食積內(nèi)熱證的癥狀多為嗜食肉食、乳類等。此外，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，便秘患者中年輕女性占比略高于男性，且隨年齡增長，差異逐漸減少[10，11]。因此，本研究以初斷乳雌性大鼠為實驗對象，以舌色、尿液顏色、糞便性狀、腸鳴音、冷熱板趨向、直腸溫度作為考察指標(biāo)，建立胃腸積熱大鼠模型。

本研究以北京中醫(yī)藥大學(xué)谷曉紅團(tuán)隊所提供的積熱飼料處方喂食大鼠。在造模過程中，各組大鼠均有不同程度的食量降低、腹圍增大、體質(zhì)量增加緩慢，大便間隔長、粒數(shù)減少且黃臭，小便色黃，舌暗紅、肛門紅腫等癥狀，但大便干結(jié)癥狀并不明顯。我們考慮到胃腸積熱證是陽明經(jīng)證和陽明腑證二者形成的“證前階段”，為防止過長時間喂食積熱飼料導(dǎo)致積熱證轉(zhuǎn)變，本研究選擇洛哌丁胺進(jìn)行干預(yù)，以加速積熱證的形成。洛哌丁胺是常見的治療腹瀉用藥[12]，干預(yù)后大鼠表現(xiàn)出明顯的大便干結(jié)癥狀，并且胃腸積熱證的表征進(jìn)一步加重。因此，本研究對積熱飼料喂食時間、洛哌丁胺給藥時間和洛哌丁胺給藥劑量三因素進(jìn)行了考察，以期得到最佳胃腸積熱證大鼠模型的建立條件。

正交設(shè)計是一種可以廣泛用于各研究領(lǐng)域中對多因素多水平進(jìn)行研究的設(shè)計方法[13，14]。這種設(shè)計方法是從全面實驗中依據(jù)正交性選取具有代表性的實驗進(jìn)行考察。與全因素全水平的全搭配設(shè)計相比，可減少實驗次數(shù)，節(jié)約成本，提高實驗效率，可快速篩選出最優(yōu)的實驗條件。胃腸積熱證的主要病因是內(nèi)熱郁積于體，因此，本研究主要從積和熱的兩方面采用正交設(shè)計的方法，將積熱飼料的喂食時間、洛哌丁胺給藥劑量、洛哌丁胺給藥時間作為考察因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗。

成功的中醫(yī)證候模型必須滿足兩個條件:一是擬定的干預(yù)因素應(yīng)是所造證候的主要影響因子，二是采用的擬定干預(yù)因素所致的病理變化應(yīng)當(dāng)是所造的證候[8]。本研究主要從胃腸積熱證的“胃腸蓄熱，阻滯而積，郁久化熱”病因出發(fā)，采用積熱飼料聯(lián)合洛哌丁胺的方法模擬胃腸積熱證的發(fā)病條件，并運用動物行為學(xué)及圖像采集技術(shù)等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)將中醫(yī)證型中的描述性指標(biāo)進(jìn)行量化對比，以期能夠更全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確地評價胃腸積熱證大鼠模型。為驗證所建胃腸積熱證大鼠模型的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究將第1～9組所有指標(biāo)與對照組進(jìn)行比較，以更好地觀察模型宏觀指標(biāo)的變化及穩(wěn)定情況；同時將給予洛哌丁胺前后的所有指標(biāo)進(jìn)行比較，以更好地觀察在造模過程中洛哌丁胺的作用及對大鼠宏觀指標(biāo)的影響。

舌診是觀察患者舌質(zhì)和舌苔變化以診察疾病的方法，是中醫(yī)望診的重要內(nèi)容。本實驗發(fā)現(xiàn)，胃腸積熱證大鼠的舌相與對照組比較有明顯差異，積熱飼料喂食4周時，第1～9組大鼠舌色變?yōu)轷r紅，符合中醫(yī)診斷學(xué)中紅舌主實熱的臨床意義[15]。其病機是熱使血的循行加速，舌體脈絡(luò)充盈[5]。給予洛哌丁胺后，舌色中紅色、綠色像素值下降，藍(lán)色像素值相對升高，舌色也由紅色發(fā)展為深紅至絳紅色，是胃腸積熱證典型的陽熱癥狀[9]。飼養(yǎng)8周時，大鼠舌相鮮紅色最明顯，繼續(xù)飼養(yǎng)至12周時，鮮紅色減退。大鼠在洛哌丁胺干預(yù)后均呈絳紅舌，表明洛哌丁胺對大鼠舌色影響較顯著，可用于構(gòu)建胃腸積熱動物模型。

尿液顏色是反映機體健康狀況的重要觀測指標(biāo)，對尿液“發(fā)黃”癥狀進(jìn)行診斷時，主要分析尿液顏色中藍(lán)色像素值。積熱飼料飼養(yǎng)4周后，大鼠尿液已由淺黃或無色變至深黃色；但12周時，在給予洛哌丁胺灌胃后“黃尿”的癥狀稍解，可能由于隨積熱癥狀逐漸加重，大鼠陰液匱乏，渴喜冷飲，飲水量增加所致，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

胃腸積熱證主要由飲食不節(jié)或過食肥甘厚味引起，由于運化不利，使飲食積于胃腸之中，日久不化，陽氣內(nèi)郁，蘊而化熱，形成胃腸積熱之證[16]。我們采用積熱飼料飼養(yǎng)大鼠4周后，大鼠糞便性狀評分有下降的趨勢，排泄物以斷邊光滑的柔軟塊狀黃臭糞便為主，且肛門污穢。為加強內(nèi)熱之“積”的作用，本研究采用洛哌丁胺干預(yù)，使糞便的性狀評分顯著升高，引起大鼠大便干燥，用以模擬胃腸積熱證陽氣內(nèi)郁、蘊于胃腸的發(fā)病機制。

腸鳴音是由于腸蠕動造成腸內(nèi)容物之間以及腸內(nèi)容物與腸壁間摩擦、撞擊產(chǎn)生的聲音，從腸壁可傳導(dǎo)至腹壁[17]。腸鳴音作為人體常見生理信號，可用于腸道相關(guān)疾病的診斷。目前，臨床最常用的腸鳴音診斷方法是用聽診器聽診，因此本研究在保證聽診環(huán)境安靜的前提下，盡量減少運動所造成的影響，并延長聽診時間至5 min，以觀察大鼠腸蠕動情況。結(jié)果表明，喂食積熱飼料后各組大鼠的腸鳴音次數(shù)減少，說明長期食用積熱飼料易引起胃腸運動功能障礙[18]，腸蠕動減弱，內(nèi)容物推進(jìn)緩慢，進(jìn)而引起排便間隔延長、排便量少等癥狀[19]。給予洛哌丁胺后，大鼠的腸鳴音次數(shù)降低，與各組給予洛哌丁胺之前相比，第5、7、8、9、組大鼠腸鳴音次數(shù)增加，但差異不顯著。這表明造模初期洛哌丁胺可使大鼠腸鳴音次數(shù)減少；但隨造模時間增加，洛哌丁胺對腸鳴音的影響逐漸減弱，提示洛哌丁胺應(yīng)在8周時給予，此時洛哌丁胺的造模效果優(yōu)于12周。

恒定的體溫是保證新陳代謝和生命活動正常進(jìn)行的前提，也是臨床查體的重要體征之一。第4～9組大鼠直腸溫度較對照組升高，且行為學(xué)實驗表現(xiàn)為在低溫區(qū)域停留時間延長，具有明顯的惡熱趨冷性，是典型的積熱證表現(xiàn)。這可能是由于機體處于病理狀態(tài)下所激發(fā)出的內(nèi)生致熱物質(zhì)作用于機體的生理或病理反應(yīng)[7]，或是由于積食長時間積于腸內(nèi)，腸蠕動推進(jìn)功能減弱，引起腸道內(nèi)菌群失調(diào)所致炎癥而導(dǎo)致的體溫升高，具體原因尚有待于進(jìn)一步研究。

正交設(shè)計實驗的結(jié)果顯示，積熱飼料喂食8周、洛哌丁胺給藥劑量12 mg/kg、持續(xù)給藥10 d是胃腸積熱證大鼠的最佳造模條件。本研究對所得最佳模型條件進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠舌色、尿色、糞便性狀、腸鳴音、冷熱板趨向、直腸溫度等指標(biāo)均發(fā)生明顯變化，且穩(wěn)定可重復(fù)，表明胃腸積熱證大鼠模型造模成功。因此，積熱飼料喂食8周、洛哌丁胺12 mg/kg持續(xù)給藥10 d可以成功構(gòu)建大鼠胃腸積熱模型。