基于宏基因組的青海農用沼氣池微生物組成和功能分析

韓 睿 陳來生 李全輝 李 屹 鐘啟文 朱德銳

(1.青海大學農林科學院青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室， 西寧 810016；2.青海大學醫學院基礎醫學研究中心， 西寧 810016)

0 引言

發展沼氣是一種極具應用前景、可解決農村能源供應問題和環保問題，以及實現農業可持續發展的有效途徑[1]。溫度是制約沼氣發酵效率的關鍵因素之一[2-3]。青海省自2003年實施農村沼氣能源建設項目以來，在開發和建設方面取得了一定成效，但受溫度的影響，絕大多數沼氣池存在產氣量少、產氣率低、運行狀況差和利用效率低等問題，嚴重影響了沼氣的推廣普及[4]。為解決此問題，沼氣用戶曾采用覆蓋塑料薄膜、畜禽舍下建造沼氣池及池體進出口加蓋等措施給沼氣池升溫和保溫，但仍不能增加產氣量和提高利用率，無法滿足農戶基本需求，亟需開發出針對沼氣發酵工藝的新技術。高效穩定的微生物生態系統是沼氣池穩定運行和提高沼氣產氣率的保證。文獻[5]研究顯示，小容量沼氣池中不同底物對微生物群落分布變化及甲烷產生具有影響；文獻[6]對沼氣生產過程中微生物群落的原位活動及多樣性進行了測定，發現Thermotogae和Spirochaetes菌群有活性糖基代謝功能，Fusobacteria和Cloacimonetes菌群有活性氨基酸基代謝功能；文獻[7]對生物沼氣池的樣品進行高通量測序，結果表明，產甲烷的代謝途徑中多含有酸化酶、水解酶、醋酸化酶和產甲烷酶的微生物菌群，認為后期生產中可以通過對微生物群落的監控實現優化生產。因此，深入解析沼氣發酵過程中微生物的群落組成以及群落的功能、發掘新的重要微生物功能類群、優化群落結構并調節應用，是解決青海沼氣池產氣量少、產氣率低、運行狀況差和利用效率低等問題的有效途徑。

絕大多數沼氣發酵微生物難以培養，無法采用傳統純培養方法研究微生物群落結構和代謝關系。宏基因組技術是以環境中所有微生物基因組DNA為研究對象，利用分子與信息技術系統研究微生物多樣性、群落結構以及微生物-環境的互作關系[8]。該技術無需進行繁瑣的常規分子生物學實驗，有效降低了實驗偏差。同時，從微生物群落結構水平上，宏基因組技術可全面認識微生物的生態特征和功能，尤其是涉及各種復雜環境的微生物群落的鑒定[9-14]。迄今為止，針對高海拔、高寒地區農用沼氣池微生物群落結構和功能的研究報道較少，尚缺乏足夠的理論參考依據。本文借助Illumina HiSeq 3000高通量測序技術，獲得青海省典型農用沼氣池污泥樣品的宏基因組數據，對微生物的群落結構和潛在的功能類群進行系統分析，旨在為后續改進青海沼氣發酵工藝、提高沼氣利用效率和實現沼氣發酵的穩定運行提供一定的理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 農用沼氣池

沼氣池選自青海省樂都縣蒲臺鄉李家臺村(36°21′14″N，102°27′22″E)。該村為青海省沼氣池普及和推廣效果較好的地區之一，池容積為8 m3，采用“一池三改”的模式。選取投料、進出料狀況及管護情況基本一致，且運行穩定的2戶沼氣池為研究對象。其中一戶沼氣池產氣好，全年產氣不中斷，保證農戶的三餐需求，為青海極少數沼氣池的典型代表(記為LD-G)；另一戶沼氣池產氣差，全年僅5—10月使用(11月至翌年4月基本無法使用)，為青海絕大多數的沼氣池代表之一(記為LD-B)。2戶投料均為：質量分數80%～90%豬糞+質量分數10%～20%人糞。

1.2 樣品采集

前期研究表明，青海農用沼氣池產氣量與發酵溫度呈正相關[4,15]。分別采集上述2戶全年溫度最高時期(9月上旬，即全年月平均產氣量最高)和最低時期(3月中旬，即全年月平均產氣量最低)的污泥樣品進行分析。編號如下：LD-G溫度最高和最低時期的樣品分別記為LD-GH和LD-GL，LD-B則分別記為LD-BH和LD-BL。所有樣品均來自沼氣池底部，采集后4℃封存，帶回實驗室后立即對樣品進行處理。采集LD-GH、LD-GL、LD-BH和LD-BL樣品的發酵溫度分別為15.9、5.7、12.3、3.1℃。

1.3 宏基因組DNA的提取和檢測

沼氣池污泥樣品的基因組DNA采用Qiagen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit進行提取，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在所有DNA樣本送交測序公司前，均經過NanoDrop2000型超微量分光光度計檢查DNA的含量及純度。要求樣品質量濃度大于10 ng/μL，樣品總質量大于500 ng，樣品純度(OD260/280)介于1.8～2.0之間。

1.4 宏基因組測序及基因預測分析

采用Illumina HiSeq 3000測序平臺進行高通量測序。測序數據分別經拼接、過濾、質量剪切等優化處理，得到的reads用于操作分類和功能分析；各reads經IDBA-UD (http:∥i.cs.hku.hk/～alse/hkubrg/projects/idba_ud/)軟件組裝成contigs后，利用MetaGene (http:∥metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)軟件進行基因預測，并利用cd-hit算法比較相似性獲得聚類后的基因序列。選擇核酸長度大于等于100bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。

1.5 物種分析與功能分析

使用BLASTP (BLASTVersion 2.2.28+，http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集序列分別與NR數據庫(Amino acid sequence of non-redundant protein，非冗余蛋白質的氨基酸序列數據庫)、eggNOG數據庫(evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，http:∥eggnog.embl.de/)和KEGG數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.genome.jp/kegg/)進行比對，即可分別獲得物種、COG功能和KEGG 功能注釋。比對參數e-value 均設置為1×10-5。

2 結果與討論

2.1 農用沼氣池宏基因組數據分析與基因預測

由表1可知，宏基因組測序得到的原始序列經過堿基質量動態去除處理和長度篩選，并經pair-end信息修正后(表1)，青海農用沼氣池4個樣品共獲得2.29億的reads用于操作分類和功能分析。微生物宏基因組共獲得2 604 356條組裝序列(contigs)。

表1 組裝及基因預測結果的統計Tab.1 Statistics of metagenome assembly and predicted genes

2.2 農用沼氣池微生物群落組成

根據宏基因組序列分析，共得到4域83門158綱364目674科2 299屬10 632種。由表2可知，在域分類水平上，所有樣品中相對豐度最大的均是細菌，相對豐度為56.41%～86.03%，其次為古菌，相對豐度為3.91%～4.31%。細菌與古菌的總相對豐度為60.32%～90.34%，說明細菌和古菌是青海農用沼氣池發酵系統中的主要微生物類群。病毒和真核生物含量較低，相對豐度分別為0.07%～0.11%和0.12%～0.16%。所有樣品還包含分類地位尚未明確的微生物類群，相對豐度為9.42%～39.45%，與現有生物數據庫中已知序列無相關性，也說明青海農用沼氣池發酵系統中生物多樣性豐富。綜合分析細菌和古菌的相對豐度，同一時期產氣好的樣品微生物豐度占比均大于產氣差的樣品，即LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL。另外，在各樣品中病毒均存在，雖然豐度偏低，但可能參與維持沼氣池發酵系統的平衡，也可能會對系統中底物降解的效果產生一定影響[16]。因此，青海農用沼氣池污泥樣品中的病毒類群值得后續深入研究。

2.3 細菌的群落組成

圖1顯示了青海農用沼氣池各樣品中細菌在門和屬分類水平上的物種組成情況，其中其他類群組(others)表示分別將相對豐度小于1%的門類和屬類合并后得到的物種類別。由圖1a可知，青海農用沼氣池4個樣品共計注釋門分類13個。所有樣品之中，優勢門類群依次為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，總相對豐度(72.37%～74.00%)趨向恒定。通常，上述的3種菌類群是沼氣發酵系統中的優勢類群，在水解大分子物質、產酸等方面發揮著重要的作用[17-19]。此外，互養菌門(Synergistetes)的相對豐度偏低(1.62%～4.73%)，在4個樣品中呈現明顯的規律性變化，產氣好的樣品高于產氣差的樣品，即LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，此與沼氣產氣的變化規律相一致，可能是青海農用沼氣池發酵系統中重要的產氣功能類群。互養菌門中的所有物種均為嚴格厭氧菌，廣泛分布于胃腸道、污水處理系統、土壤、口腔、厭氧污泥消化器等各種環境中，所占相對豐度較低。早期研究表明其是積極參與厭氧污泥消化的核心細菌類群之一[20-21]，可以降解丙酸、丁酸等小分子物質，并能與產甲烷菌進行互營代謝[22-24]。文獻[25]在選育耐低溫產沼氣菌群的過程中，獲得一組產沼氣菌群5號，將其用厭氧污水馴化后獲得另一組菌群Y5S。通過高通量測序技術比較分析產沼氣菌群5號、馴化菌群Y5S和厭氧污水原始菌群YJ，結果顯示3個菌群均含有Firmicutes、Bacteroidetes、Synergistetes、Proteobacteria、Spirochaetes和Verrucomicrobia。然而，在馴化菌群Y5S中，互養菌門Synergistetes所含豐度最高，是產沼氣菌群5號的9.44倍，由此表明Synergistetes門可能是沼氣系統中甲烷生產效率的一個重要影響因素。本文的研究結果也證實這一觀點，此結論為后續挖掘青海農用沼氣池的功能微生物，提供了新的研究方向和思路。

表2 4個樣品在域水平上物種的相對豐度Tab.2 Relative abundance of species at domain level in four samples %

圖1 4個樣品細菌門和屬分類水平統計Fig.1 Bacterial taxonomic classification at phylum and genus level in four samples

青海農用沼氣池4個樣品共計注釋28個屬分類(圖1b)。在LD-GH、LD-BH、LD-GL和LD-BL樣品中，其他類群組(others)的總相對豐度分別為41.70%、39.57%、38.72和38.46%。除其他類群組以外，優勢屬類群依次為海螺菌屬(Marinospirillum，相對豐度6.75%)、梭菌屬(Clostridium，相對豐度4.56%)、密螺旋體屬(Treponema，相對豐度3.60%)和假單胞菌屬(Pseudomonas，相對豐度3.01%)。平行比較分析4個樣品，海螺菌屬的相對豐度波動變化較大(2.30%～12.46%)。在LD-BL中，海螺菌屬的相對豐度(12.46%)最高，其豐度變化與產氣存在明顯的相關性，豐度越高則產氣越差，反之亦然，即LD-GH小于LD-BH，LD-GL小于LD-BL。至此，海螺菌屬可能對沼氣產氣具有一定抑制作用，有待進一步的實驗驗證。

2.4 古菌的群落組成

分別將相對豐度小于1%的目類和屬類合并到其他類群組(others)后，青海農用沼氣池4個樣品中，共計注釋到古菌類群為5目14屬(圖2)。在目分類水平上，甲烷微菌目(Methanomicrobiales)的相對豐度最高(大于84.90%)，且LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL(圖2a)。由圖2b可知，14個分類屬中，產甲烷菌屬(Methanogenium)是優勢古菌類群(相對豐度25.41%～31.65%)，且豐度變化規律與甲烷微菌目的變化規律相一致。由此表明，在青海農用沼氣池發酵系統中，產甲烷菌屬是最主要的產氣功能類群。產甲烷菌屬分類隸屬甲烷微菌科，分布廣泛，其成員均為氫代謝-營養型產甲烷菌，利用H2/CO2代謝并產生CH4，且大多數屬于中溫菌(生長溫度為30～40℃)[26-27]。極個別產甲烷菌屬成員的生長溫度寬泛，最低可達到0℃左右，如嗜冷產甲烷菌Methanogeniumfrigidum[28]。本研究中，4個沼氣池發酵溫度為3.1～15.9℃，屬于低溫范疇，比甲烷微菌科大多數古菌的正常生長溫度要低。在LD-BL樣品中，發酵溫度僅3.1℃，但產甲烷菌屬的豐度仍有25.41%，說明產甲烷菌屬可能具有特殊的生理特性和低溫適應性。在長期寒冷或溫度季節性交替條件下，甲烷菌屬參與甲烷的生產，發揮至關重要的作用，可能是青海農用沼氣池中最為優勢的古菌功能類群[29]。

圖2 4個樣品古菌目和屬分類水平統計Fig.2 Archaeal taxonomic classification at order and genus level in four samples

此外，青海農用沼氣池還存在幾種次優勢屬群，參與甲烷生產，如甲烷囊菌屬(Methanoculleus，相對豐度14.71%)、甲烷粒菌屬(Methanocorpusculum，相對豐度11.42%)、甲烷盤菌屬(Methanoplanus，相對豐度8.73%)、甲烷裂葉菌屬(Methanolacinia，相對豐度8.23%)和甲烷泡菌屬(Methanofollis，相對豐度4.19%)。上述這些屬群和產甲烷菌屬一樣，都屬于氫代謝-營養型產甲烷菌，參與CO2還原代謝途徑，由此表明氫代謝-產甲烷菌可能是青海農用沼氣發酵系統中重要的甲烷生產參與者。值得注意的是，甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)僅出現在產氣好的樣品中，如在LD-GH樣品中相對豐度為3.47%，在LD-GL樣品中相對豐度僅為0.93%，總體相對豐度偏低，且因樣品存在差異；但在產氣差的LD-BH和LD-BL樣品中，均未曾檢出。

2.5 COG功能注釋

將基因產物與eggNOG數據庫比對，獲得對應的直系同源序列聚類(COG)，得到所有樣本COG功能分類統計圖(圖3)。4個樣品中注釋到一般功能基因(General function prediction only，R)的相對豐度最高，其次為碳水化合物運輸和代謝(Carbohydrate transport and metabolism，G)，復制、重組與修復(Replication, recombination and repair，L)，氨基酸運輸和代謝(Amino acid transport and metabolism，E)，翻譯、核糖體結構與生物合成(Translation, ribosomal structure and biogenesis，J)，能源生產和轉換(Energy production and conversion，C)，細胞壁/膜生物發生(Cell wall/membrane/envelope biogenesis，M)。此外，未知功能(Function unknown，S)的相對豐度也較高，說明青海農用沼氣池樣品中可能存在大量未知功能的新型代謝基因。整體而言，注釋到各模塊的基因豐度，在各樣品中分布的變化趨勢相對一致，LD-GH略大于LD-BH，LD-GL略大于LD-BL，表明產氣好沼氣池的樣品比產氣不好的樣品具有更多的有效基因。

圖3 COG功能注釋圖Fig.3 COG function annotation diagram

2.6 微生物群落參與的甲烷代謝關系解析

圖4 基于甲烷代謝的不同樣品KEGG路徑熱圖Fig.4 Heatmaps of KEGG pathways in different samples based on methane metabolism

利用KEGG數據庫進行代謝通路分析，共注釋獲得代謝通路301個，涵蓋涉及528 078個基因。參與基因數較多的代謝通路主要集中在氨基酸的生物合成(ko01230)、碳代謝(ko01200)、ABC轉運(ko02010)、嘌呤代謝(ko0230)及嘧啶代謝(ko00240)。關聯分析甲烷代謝相關的代謝路徑，并繪制成熱圖(圖4)。結果顯示，4個樣品中甲烷代謝(Methane metabolism，ko00680)、原核生物碳固定(Carbon fixation pathways in prokaryotes，ko00720)和糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis，ko00010)的代謝路徑較為突出。在4個樣品中，上述熱點代謝通路的相對豐度均呈現LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，直接反映了產氣好的沼氣池樣品具有更強的甲烷代謝能力。

圖5 甲烷代謝途徑Fig.5 Methane metabolism pathway

在甲烷代謝路徑中，產甲烷菌參與的甲烷代謝途徑，最終會形成甲基輔酶M(CH3-S-CoM)，其在甲基輔酶M還原酶(Mcr，Enzyme commission[縮寫為EC]2.8.4.1)的催化下，以CoB為直接的電子供體還原CH3-S-CoM，最終形成CH4[30]。Mcr是甲烷代謝中的關鍵功能酶，也是產甲烷菌所特有的一種酶，對沼氣的產生發揮著至關重要的作用[31-34]。由圖5可知，4個樣品中產甲烷菌Mcr基因貢獻值為LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，說明產氣好的樣品中產甲烷菌Mcr的活性更高。

本研究中，單獨分析2種不同類型產甲烷菌參與的甲烷代謝途徑。由圖5可知，在4個樣品中，氫代謝-營養型產甲烷菌參與CO2還原途徑的所有通路非常完整。參與這些通路的重要酶，主要涉及四氫甲烷蝶呤甲酰轉移酶(EC2.3.1.101)、甲酰四氫甲烷蝶呤環化水解酶(EC3.5.4.27)、甲酰四氫甲烷蝶呤脫氫酶(EC1.5.98.1)以及甲酰四氫甲烷蝶呤還原酶(EC1.5.98.2)等。在4個樣品中，基因的貢獻豐度為LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，表明在產氣好的樣品中，氫代謝-營養型產甲烷菌以H2作為電子供體，還原CO2產生CH4的能力更強。通常情況下，乙酸代謝-營養型產甲烷菌參與的乙酸代謝過程生產甲烷，首先以乙酸為底物，經乙酸激酶(EC2.7.2.1，Ack)、磷酸轉乙酰酶(EC 2.3.1.8，Pta)或乙酰CoA合成酶(EC6.2.1.1，Acs)等酶催化生成乙酰CoA。然后，乙酰CoA再在一氧化碳脫氫酶/乙酰CoA合成酶復合體(Codh/Acs，關鍵酶)，再與四氫甲烷喋呤(H4MPT)經一系列酶及輔酶的催化作用生成CH4。但從圖5可知，4個樣品中Codh/Acs基因均未檢出，說明乙酸代謝-營養型產甲烷菌參與乙酸生產甲烷的代謝通路不完整。本研究中，宏基因組檢測到兩種乙酸代謝-營養型產甲烷菌，即甲烷鬃菌屬(Methanothrix)和甲烷八疊球菌屬。前者的相對豐度很低(小于0.1%)，從數量上可能導致其能提供的酶基因豐度非常低，近似忽略；而后者盡管有所檢出(相對豐度0.93%～3.47%，圖3)，但由于其具有多細胞集聚，可同時擁有3種CH4合成途徑：利用H2/CO2、利用乙酸或利用甲基合成CH4[35]。本研究中，甲烷八疊球菌屬可能僅參與利用H2/CO2生成甲烷的代謝途徑，而未通過利用乙酸生成甲烷的代謝途徑。

此外，青海農用沼氣發酵系統中，可能還存在其他微生物參與乙酸的各類生化代謝，從圖5可知其代謝過程。首先，乙酰CoA在丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(EC1.2.7.1)的催化作用下生成丙酮酸，再在一系列酶的作用下丙酮酸生成亞甲基四氫甲烷蝶呤。然后，由氫代謝-營養型產甲烷菌經CO2還原途徑最終生成CH4。對比分析4個樣品，其他微生物參與的乙酸代謝通路，涉及所有酶基因的相對豐度為LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL。通常情況下，沼氣系統中所生成的CH4，60%～70%來自乙酸鹽的轉化，約30%源自H2氧化和CO2還原。本研究發現青海農用沼氣池發酵系統與目前的主流觀點不一致，可能是因為青海獨特的氣候類型和地理環境所致，特別是這種特殊的低溫發酵條件不利于乙酸代謝-營養型菌株行使功能[36]。因此，青海農用沼氣池發酵系統中，甲烷產生的生化代謝過程可能主要依賴于H2/CO2合成途徑。

3 結論

(1)基于宏基因組技術獲得的物種注釋表明，青海農用沼氣池發酵系統中蘊藏著豐富的微生物種群。細菌可劃分為13門28屬，優勢門分類類群依次是擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，在發酵系統中發揮著關鍵作用。互養菌門可能是沼氣生產重要的功能類群。在屬水平上，優勢類群是海螺菌屬、梭菌屬、密螺旋體屬和假單胞菌屬。古菌可劃分為5目14屬，隸屬甲烷微菌目的產甲烷菌屬是最優勢古菌類群，也是產甲烷的最主要功能類群。

(2)基于代謝功能注釋結果表明，產氣好比產氣差的樣品具有更多的有效基因，參與甲烷代謝相關路徑的功能基因豐度更高。在所有樣品的甲烷代謝途徑中，氫代謝-營養型產甲烷菌參與CO2還原途徑的全部通路，非常完整，但產氣好的樣品功能酶基因豐度更高，產甲烷的能力更強。在青海農用沼氣發酵系統中，甲烷產生的途徑主要依賴于H2氧化/CO2還原的合成。