不同分子質(zhì)量牛骨膠原多肽制備復(fù)合膜特性研究

姚玉梅 袁湘汝 韓魯佳 楊增玲 劉 賢

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083)

0 引言

目前，資源短缺和白色污染問題日益加劇[1]，基于天然高分子原料開發(fā)生物基復(fù)合材料已成為高分子科學(xué)和材料科學(xué)的前沿領(lǐng)域之一。作為農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)副產(chǎn)品的高附加值產(chǎn)品，基于動物骨資源酶解制備的膠原多肽(Collagen polypeptide, CP)因其優(yōu)異的無毒性、低刺激性、熱塑性、可降解性和獨(dú)特的生物功能活性[2]，而成為一種具有廣泛應(yīng)用前景、環(huán)境友好型可再生高分子材料[3]。膠原多肽材料具有良好的生物相容性和可調(diào)控的降解性，在復(fù)合膜[4]、粘結(jié)劑[5]、表面活性劑[6]和生物醫(yī)用材料[7]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，是開發(fā)綠色可再生資源的有效策略[8]。但是，單一膠原多肽材料脆性大、硬度高、親水性強(qiáng)、力學(xué)性能差，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的條件[9]。羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose, CMC)是纖維素最重要的衍生物之一，具有良好的保水性、分散穩(wěn)定性和成膜性[10]，能夠通過改性引入新的基團(tuán)或化合物來增添一些新的性能[11]，常作為生物質(zhì)基質(zhì)和生物制品載體使用。

復(fù)合材料的綜合性能受所用原材料的自身性能與改性作用的影響顯著[12]。有研究者考察了膠原多肽與羧甲基纖維素共混對復(fù)合膜性能的影響，結(jié)果表明，與單一膠原多肽的材料性能相比，經(jīng)羧甲基纖維素改性后制備的復(fù)合材料具有更為優(yōu)異的理化性能，其熱穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度、疏水性和延展性均明顯提高[13-14]，并可兼顧抗氧化性、抗菌性、止血性等其他特性[11, 15]。此外，膠原多肽的濃度、顆粒尺寸、分子質(zhì)量及生物功能活性也會影響復(fù)合材料的綜合性能[16]。然而，膠原多肽作為膠原蛋白的水解產(chǎn)物，在實(shí)際生產(chǎn)中常因水解度低、水解不徹底等原因[17]，而導(dǎo)致其分子質(zhì)量較大、分布較寬，使得材料性能不易控制。目前，膠原多肽的分子質(zhì)量對復(fù)合膜材料性能影響的相關(guān)研究較少，且未見對其影響機(jī)理的探討。

力學(xué)性能與疏水性是反映復(fù)合膜綜合利用價值的評價指標(biāo)，生物相容性是評估材料穩(wěn)定性與可靠性的必要條件，兩者都將決定材料最終能否應(yīng)用于實(shí)際。為探討膠原多肽的分子質(zhì)量對膠原多肽-羧甲基纖維素(CP-CMC)復(fù)合膜力學(xué)性能的影響，本文以溶液流延法制備4種不同膠原多肽分子質(zhì)量的CP-CMC復(fù)合膜，并分別測定復(fù)合膜的力學(xué)性能、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性能，探討分子質(zhì)量對復(fù)合材料的影響機(jī)理，以期為后續(xù)動物骨資源的高值化轉(zhuǎn)化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)材料：牛骨膠原多肽1(CP1)由賽森化工產(chǎn)品有限公司提供，平均分子質(zhì)量為700 u；牛骨膠原多肽2(CP2)由北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司提供，平均分子質(zhì)量為1 000 u；牛骨膠原多肽3(CP3)由北京盛美諾生物技術(shù)有限公司提供，平均分子質(zhì)量為3 000 u；牛骨明膠4(CP4)由賽森化工產(chǎn)品有限公司提供，平均分子質(zhì)量為20 000 u。羧甲基纖維素(99%，分析純，山東西亞化工科技有限公司)，甘油(99%，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：RW20數(shù)顯型電動攪拌器(德國IKA公司)；SevenEasy實(shí)驗(yàn)室pH計、XS105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Se-KTQ-150A型可調(diào)制膜器(沈陽科晶自動化設(shè)備有限公司)；TCYQ型水浴恒溫振蕩器(蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；3367型雙立柱臺式電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)(美國Instron公司)；OCA21型接觸角測量儀(德國Dataphysics公司)；SU3500型掃描電子顯微鏡(天美有限公司)；Spectrum400型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)；D8 Advance 型X射線衍射儀(德國Bruker公司)；SDT Q 600型熱重分析儀(美國TA公司)。

1.2 CP-CMC復(fù)合膜的制備

CP-CMC復(fù)合膜的制備流程是對溶液流延法[18]加以改進(jìn)。首先，將羧甲基纖維素溶解于蒸餾水中，在室溫(20℃)下用攪拌器快速(600 r/min)攪拌至完全溶解，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的CMC水溶液(溶液A)；其次，將不同分子質(zhì)量的牛骨膠原多肽/明膠溶解于蒸餾水中，用2.0 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至10.0，在80℃下將其連續(xù)攪拌1 h制備8%的水溶液(溶液B1、B2、B3、B4)；再次，將溶液A和B按1∶1的質(zhì)量比混合，以甘油作為增塑劑，添加量為成膜液的3%，充分?jǐn)嚢杌旌先芤菏蛊浜蔀榫鶆虻某赡ひ海蛔詈螅?.09 MPa真空度下脫氣20 min后，稱取相同質(zhì)量的成膜液在聚四氟乙烯板上流延，并使用可調(diào)制膜器調(diào)節(jié)復(fù)合膜的初始厚度，然后將聚四氟乙烯板在干燥箱中50℃條件下干燥6 h拿出，于室溫下放置24 h，將干燥的薄膜完整地剝離，編號為M1、M2、M3、M4(對應(yīng)溶液B1、B2、B3、B4)。在不添加膠原多肽類物質(zhì)條件下，以相同制備工藝制備單一CMC薄膜樣品作為對照組樣品M0。

1.3 CP-CMC復(fù)合膜理化性質(zhì)

1.3.1力學(xué)性能測試

將5種膜樣品分別切割成寬25 mm、長80 mm的長條，于測試前分別在溫度23℃、相對濕度(50±3)%下的恒溫恒濕箱中調(diào)節(jié)2 d，并使用靈敏度為1 μm的千分尺測量膜樣品的厚度d。利用標(biāo)準(zhǔn)方法使用ASTM D882-02型電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)測試膜樣品拉伸強(qiáng)度，略有改動[19]。將膜樣品兩端固定于夾具上，夾持距離為45 mm，拉伸速率為5 mm/min，通過計算機(jī)軟件從拉伸應(yīng)力-應(yīng)變圖自動計算楊氏模量，每種類型的膜樣品重復(fù)測量8次。拉伸強(qiáng)度計算公式為

(1)

式中LP——膜拉伸過程中的峰值強(qiáng)度，N

A——膜樣品的斷面面積，m2

在靜態(tài)模式下測量膜樣品的斷裂強(qiáng)度[19]，每種類型的膜樣品重復(fù)測量8次。斷裂伸長率計算公式為

(2)

式中 ΔL——斷裂時的長度增量，mm

L——試樣原長，mm

1.3.2水溶性測定

參照文獻(xiàn)[20]的方法測定膜樣品的水溶性，略有改動。將膜樣品切割成50 mm×50 mm的矩形片，并在60℃和0.01 MPa下干燥24 h后稱量，作為樣品的初始干質(zhì)量W0。將每個膜樣品浸入250 mL燒杯中的200 mL蒸餾水中，并放至(25±0.1)℃的水浴振蕩器中振蕩一段時間。6 h后將膜樣品拿出，并于60℃和0.01 MPa下干燥24 h以確定最終干質(zhì)量W1。由初始和最終干質(zhì)量計算膜樣品的水溶性指數(shù)S，公式為

(3)

1.3.3表面親水性評價

為探究分子質(zhì)量對膜樣品疏水性的影響，采用接觸角測量儀測定膜樣品與水的靜態(tài)接觸角[18, 21]。其中，膜樣品尺寸為2.0 cm×2.0 cm，在表面滴加2 μL蒸餾水，靜止一段時間后拍照，觀察其浸潤情況。

1.4 CP-CMC復(fù)合膜表征分析

1.4.1微觀結(jié)構(gòu)(SEM)

采用掃描電子顯微鏡對膜樣品的表面形態(tài)進(jìn)行表征。測試條件：膜樣品脫水后用離子濺射儀對其表面噴金制樣，儀器的加速電壓為15 kV，工作距離10 cm。

1.4.2傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

采用傅里葉變換紅外光譜儀對5種成膜粉末樣品及其膜樣品進(jìn)行官能團(tuán)特征分析，參照文獻(xiàn)[22]略有改動。本實(shí)驗(yàn)采用KBr壓片法，即將光譜級KBr和待測樣品分別經(jīng)瑪瑙研缽充分研磨后，以1∶100質(zhì)量比混勻。稱取150 mg混合試樣在壓片機(jī)壓制壓力40 MPa下保壓1.5 min，制成透明薄片。檢測時，紅外分析掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1。

1.4.3X射線衍射(XRD)

采用X射線衍射儀分析膜樣品的結(jié)晶度差異性。一般情況下，結(jié)晶度越高，熔點(diǎn)越高，韌性越差，透光性越差。具體參數(shù)設(shè)置如下[18]：在CuKα射線下，X光管電壓40 kV，管電流40 mA，5°～60°范圍內(nèi)，步長為0.02°，掃描頻率為2(°)/min，測定X射線衍射圖譜，并利用軟件MDI-Jade 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用熱重分析儀對5種成膜粉末樣品及其膜樣品進(jìn)行熱解特性實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[23]略有改動。為保證樣品均勻性，將待測樣品經(jīng)瑪瑙研缽充分研磨。稱取5～6 mg研磨樣品于坩堝中，隨后開始實(shí)驗(yàn)。使用條件及相關(guān)參數(shù)為：以氮?dú)鉃檩d氣，流速為100 mL/min；以10℃/min的升溫速率升溫到700℃。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5制圖。數(shù)據(jù)均采用SPSS V20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，在95%置信區(qū)間認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CP-CMC復(fù)合膜的力學(xué)性能

表1 列出了4種復(fù)合膜的力學(xué)性能數(shù)據(jù)。由表可知，對比對照組M0，CP的添加顯著改變復(fù)合膜的綜合機(jī)械性能，即除M4外，復(fù)合膜具有更高的拉伸強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度和楊氏模量。進(jìn)一步分析可知，隨著CP分子質(zhì)量的增加，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量呈顯著降低趨勢，斷裂強(qiáng)度呈先降低后增加再降低的趨勢，在分子質(zhì)量為700 u時為最大值；而隨著CP分子質(zhì)量的增加，膜樣品的斷裂伸長率增加，當(dāng)分子質(zhì)量大于3 ku時，膜的斷裂伸長率開始下降。分析M1～M4膜樣品的力學(xué)性能數(shù)據(jù)與CP分子質(zhì)量的關(guān)系可知，在分子質(zhì)量為700 u時，復(fù)合膜的力學(xué)性能最佳，拉伸強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度和楊氏模量分別較對照組提升2.39、2.55、10.11倍，斷裂伸長率較對照組降低40%，隨后在分子質(zhì)量為1 000 u時，復(fù)合膜力學(xué)性能較好。這可能是由于較小的分子質(zhì)量可以軟化膜的剛性，增加膜的柔韌性，提高膜的拉伸強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度和楊氏模量[24-25]；分子質(zhì)量較高的CP與CMC的相容性較差，影響膜樣品的力學(xué)性能[18]。

表1 CP分子質(zhì)量對CP-CMC復(fù)合膜力學(xué)性能的影響Tab.1 Effects of molecular weight distribution of CP on mechanical properties of CP-CMC composite films

注：同列不同小寫字母表示組間差異顯著(p<0.05)。

2.2 CP-CMC復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)性能

2.2.1相容性

在圖1 (2θ表示角度變化)可以看到，M0在2θ=20°時出現(xiàn)強(qiáng)衍射峰，是羧甲基纖維素的特征衍射峰[26]。由M1～M4的XRD譜圖變化可知，隨著CP分子質(zhì)量的增加，衍射峰寬度逐漸變寬，強(qiáng)度逐漸減弱，并且衍射峰的位置發(fā)生移動，表明復(fù)合膜的結(jié)晶能力逐漸減弱。這主要是由于復(fù)合膜中各組分之間存在強(qiáng)烈的作用，反應(yīng)所形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)限制了羧甲基纖維素分子鏈的活動性，破壞了其原有的晶體結(jié)構(gòu)[27]。

圖1 5種膜樣品的XRD譜圖Fig.1 XRD spectra of five kinds of film samples

圖2是粉末原料與復(fù)合膜樣品的熱重分析結(jié)果。如圖2a、2b所示，所有成膜原料在升溫開始階段50～150℃范圍有一個很小的失重峰，這明顯是樣品中水分的蒸發(fā)過程；150～350℃范圍樣品的失重速率明顯提高，并達(dá)到峰值。其中，CMC在280℃發(fā)生明顯失重，失重率為21.33%，這是由于羧甲基纖維素開始降解，—COO—氧化釋放出CO2，從而質(zhì)量迅速下降[18]。不同分子質(zhì)量CP的失重曲線相差不大，均在290℃發(fā)生明顯失重，其中CP1的失重率最高，為29.04%。由圖2c、2d可知，對比單一CMC薄膜樣品的TGA曲線，添加不同分子質(zhì)量的CP后，復(fù)合膜樣品失重范圍大致類似，膜樣品的失重率降低，且最大的降解溫度向右偏移。其中，CP2對降低復(fù)合膜的最終失重率和提高最大失重速率的峰溫具有明顯作用。以上數(shù)據(jù)說明，復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性有了較大的提升，這是由于CP與CMC的相容作用改善了膜樣品的結(jié)構(gòu)，造成了熱解溫度的變化。由圖2還可以看出，相對于其它復(fù)合膜樣品而言，M0膜樣品前期水分的蒸發(fā)失重多，說明單一CMC薄膜樣品具有較強(qiáng)的吸水性。

圖2 5種成膜原料及其膜樣品熱解特性的熱重分析Fig.2 Pyrolysis characteristics of five kinds of film forming materials and their film samples using thermogravimetric analysis

2.2.2傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

圖3 5種成膜原料及其膜樣品的FT-IR圖Fig.3 FT-IR spectroscopy of five kinds of film forming materials and their film samples

2.2.3微觀結(jié)構(gòu)(SEM)

圖4 5種膜樣品的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of five kinds of film samples

圖4是單一CMC薄膜樣品與4種CP-CMC復(fù)合膜樣品的表面微觀結(jié)構(gòu)圖。在500倍掃描電鏡下，圖4a 顯示單一CMC薄膜樣品表面存在少許溝槽、褶皺，圓形或橢圓形CMC疏松堆積排列(圖4b)，這樣的材料結(jié)構(gòu)單一且不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響薄膜的力學(xué)性能與疏水性；圖4c～4f分別顯示添加了不用分子質(zhì)量CP制備的復(fù)合膜表面明顯變得光滑、致密和連續(xù)，說明CP與CMC在溶液中具有較好的相容性，對膜結(jié)構(gòu)的影響較大。結(jié)合5種膜樣品的力學(xué)性能、相容性和FT-IR等結(jié)果，說明CMC與CP的結(jié)合將會改變膜樣品的表面微觀形態(tài)，提高復(fù)合膜的相關(guān)機(jī)械強(qiáng)度，改善結(jié)晶度，并使得結(jié)構(gòu)更加均勻，尺寸穩(wěn)定性增加[24]。隨著添加CP分子質(zhì)量的增加，復(fù)合膜樣品的表面越來越粗糙(圖4c～4f)，這是因?yàn)檩^高分子質(zhì)量的CP為固體結(jié)晶狀，易導(dǎo)致成膜后少量析出[18]。此外，明膠-羧甲基纖維素復(fù)合膜樣品的微觀結(jié)構(gòu)中存在較多氣泡(圖4f)，這是由于明膠的分子質(zhì)量較大，仍保存部分蛋白質(zhì)的特性，具有優(yōu)異的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

2.3 CP-CMC復(fù)合膜的疏水性

圖5 5種膜樣品的靜滴接觸角Fig.5 Contact angle determination of five kinds of film samples

水溶性和表面親水性通常由分子結(jié)構(gòu)決定，包括結(jié)晶度和交聯(lián)，是膜樣品熱穩(wěn)定性、微觀形態(tài)和疏水性的反映。一般來說，水溶性越小，表觀接觸角越大，表面越疏水[21, 31]。對照組樣品的水溶性指數(shù)為63.55%，而復(fù)合膜M1～M4的水溶性指數(shù)分別為41.00%、34.91%、41.32%、40.16%。CP的添加使得復(fù)合膜樣品的水溶性顯著降低，且復(fù)合膜的水溶性隨CP分子質(zhì)量的增加呈先降低后增加趨勢，且M2膜的水溶性最低。結(jié)合SEM 的結(jié)果分析可知：隨著復(fù)合膜樣品結(jié)構(gòu)密度的增加，疏水性逐漸增加。由圖5可知，對照組樣品的接觸角為33.94°，而復(fù)合膜M1～M4的接觸角分別為45.77°、50.06°、30.93°、82.91°；隨著CP分子質(zhì)量的增加，接觸角呈先增大后減小再增大的趨勢，這說明CMC與CP共混在一定程度上可以提升膜樣品表面的疏水性。相較于對照組，在CP分子質(zhì)量為1 000 u時，復(fù)合膜的水溶性指數(shù)降低了28.64個百分點(diǎn)，即降低了45%，接觸角提高了16.12°，充分表明低分子質(zhì)量的CP有利于改善復(fù)合膜樣品的疏水性。這是由于CP分子質(zhì)量的變化會引起其表面疏水性、溶解度等性能的變化[32]。此外，復(fù)合膜M4的接觸角最好，且吸水溶脹程度大，這是由于明膠保留了蛋白質(zhì)的部分特性，使得復(fù)合膜樣品表面具有一定的疏水性，可作為一種發(fā)泡劑應(yīng)用。

3 結(jié)束語

以4種不同分子質(zhì)量的膠原多肽為研究對象，制備了4種復(fù)合膜樣品，并對獲得的膜樣品進(jìn)行了微結(jié)構(gòu)與性能分析。研究發(fā)現(xiàn)，添加膠原多肽/明膠可以明顯改善膜樣品的力學(xué)性能、疏水性、相容性和表面微觀結(jié)構(gòu)。在膠原多肽分子質(zhì)量為700～1 000 u時，復(fù)合膜具有更高的拉伸強(qiáng)度和更低的斷裂伸長率，熱穩(wěn)定性和疏水性最高，即最高降解溫度由280℃升至290℃；在分子質(zhì)量為1 000 u時，水溶性指數(shù)降低45%，接觸角提高16.12°；隨著膠原多肽分子質(zhì)量的增加，復(fù)合膜的力學(xué)性能降低，表面微觀結(jié)構(gòu)粗糙，并出現(xiàn)較多氣泡，疏水性降低。研究結(jié)果表明，膠原多肽的分子質(zhì)量對其復(fù)合膜材料具有顯著影響，且700～1 000 u為膠原多肽向復(fù)合膜材料轉(zhuǎn)化的最佳分子質(zhì)量區(qū)間。