基于網絡藥理學分析藿樸夏苓湯作用機制以探討新型冠狀病毒肺炎的治療?

付 暢，趙 勇，謝 敏，肖紅慧，李會敏，楊哲昀，左新河，△

(1.湖北中醫藥大學，武漢 430061；2.湖北省中醫院，武漢 430074)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)具有傳染性強、流行性廣等特點，屬于中醫學“疫病”范疇[1]。自其發生以來治療方案得到不斷更新，但還沒有特效藥，目前多采用中西醫結合治療方式，中醫藥的參與對于改善癥狀、防止惡化、促進康復等起到重要作用[2]。COVID-19以發熱、干咳、乏力為主要表現，初期患者中可見納呆嘔惡、大便黏膩不爽、苔白厚或白膩等濕濁之象[3]。熊繼柏[4]認為此乃邪犯胃腸所致，可以運用藿樸夏苓湯進行治療。藿樸夏苓湯由廣藿香、厚樸、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、豬苓、淡豆豉、澤瀉、通草等芳香化濕、苦溫燥濕、淡滲利濕藥物組成，具有宣通肺氣、健脾化濕、通利小便之效，在濕溫發熱中得到運用，取得了良好療效[5]。藿樸夏苓湯在多個新型冠狀病毒肺炎診療方案中被推薦使用，在四川省中醫藥管理局開展的《醫院制劑“新冠2號、3號”推廣暨臨床療效評價研究》科研應急專項中，“新冠2號”是由銀翹散合藿樸夏苓湯加減而成，“新冠3號”也是由荊防敗毒散合藿樸夏苓湯加減而成[6]。故本研究擬采用網絡藥理學方法，分析藿樸夏苓湯的組方成分、靶點及潛在作用機制，探討其對COVID-19的治療作用，為進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藿樸夏苓湯活性成分篩選

本研究通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，依次以藿樸夏苓湯的組成廣藿香、厚樸、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、豬苓、淡豆豉、澤瀉、通草等為關鍵詞進行檢索，并設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為條件進行篩選，得到各味中藥的活性成分。

1.2 活性成分靶點的獲取及藥物-成分-靶點網絡的構建

通過TCMSP獲取活性成分對應的靶點，使用Uniport數據庫(https://www.uniprot.org)設置物種為人，將得到的靶點名稱轉換為對應的基因名稱，使用Cytoscape 3.6.0軟件構建藥物-成分-靶點網絡圖。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選

將獲取的藿樸夏苓湯組方藥物活性成分靶點輸入到STRING數據庫(https://string-db.org)進行靶點PPI分析，將PPI數據導入到Cytoscape 3.6.0軟件構建網絡，并運用MCODE及CentiScaPe插件進行模塊化、拓撲學分析，篩選關鍵靶點。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將篩選的關鍵靶點導入到DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov)，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并用在線繪圖網站Omicshare(https://www.omicshare.com)將得到的結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 藿樸夏苓湯活性成分及靶點

通過TCMSP獲取到符合篩選條件的藿樸夏苓湯活性成分，其中查詢到靶點的活性成分為廣藿香9種，厚樸2種，半夏12種，茯苓7種，苦杏仁16種，薏苡仁6種，豆蔻12種，豬苓7種，淡豆豉1種，澤瀉7種，通草3種，合并后共有71種不同成分對應235個靶點。

2.2 藿樸夏苓湯藥物-成分-靶點網絡圖

圖1示，運用Cytoscape 3.6.0軟件構建藥物-成分-靶點網絡圖，網絡中共有316個節點1146條邊，包含11個藥物71個成分235個靶點。按節點度值排序，排名在前的活性成分有槲皮素、豆甾醇、木犀草素、黃芩素和β-谷甾醇等成分。

圖1 藥物-成分-靶點網絡圖

2.3 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選

圖2示，將藿樸夏苓湯作用的235個靶點導入STRING數據庫進行PPI分析。運用Cytoscape 3.6.0軟件處理，在網絡中有231個節點4164條邊。圖3示，使用MCODE插件對網絡進行模塊化分析，設定K-Core為4，得到4個模塊K-Core大于4。其中模塊1得分46.677分，包含63個節點1447條邊；模塊2得分13.000，包含13個節點78條邊；模塊3得分5.714分，包含8個節點20條邊；模塊4得分5.385分，包含27個節點70條邊。表1示，運用CentiScaPe插件對網絡進行拓撲學分析，網絡中度平均值36.052，中介中心性平均值248.442，緊密中心性平均值為0.002，篩選得到41個關鍵靶點。

圖2 靶點PPI圖

圖3 PPI網絡MCODE模塊化圖

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

圖4、5示，運用DVAID對篩選的關鍵靶點進行GO功能富集分析(P<0.05)，得到72個條目，其中生物過程44條，細胞組成7條，分子功能21條，按P值排序前20條。對篩選的靶點進行KEGG通路富集分析(P<0.05)，得到73個信號通路，按P值排序前20條。

表1 靶點網絡拓撲數據比較

圖4 GO功能富集分析氣泡圖

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

COVID-19是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引發的疾病。SARS-CoV-2屬于β型冠狀病毒[7]，它能通過其表面的棘突蛋白與人體細胞表面的血管緊張素轉化酶2(ACE2)受體結合而進入到細胞中[8]。SARS-CoV-2棘突蛋白與ACE2受體的結合下調ACE2的表達，導致血管緊張素Ⅱ水平升高，血管緊張素Ⅱ通過結合其受體Ⅰ型和Ⅱ型發揮血管活性作用，增加肺血管通透性，誘導急性肺損傷[9]。研究發現，ACE2受體除在Ⅱ型肺泡上皮細胞和呼吸道上皮細胞高表達外，還在心肌細胞、腎近曲小管上皮細胞、膀胱上皮細胞、食道和回腸上皮細胞均有表達[10]，提示SARS-CoV-2對心臟、腎臟等其他器官也具有殺傷力。COVID-19除引起典型的呼吸系統癥狀外，對心血管、消化、泌尿系統也都有影響，能造成多臟器衰竭，嚴重者導致死亡[11-12]。

通過網絡藥理學分析發現，藿樸夏苓湯的11味中藥含有71種活性成分，在網絡中度值高的活性成分有槲皮素、豆甾醇、木犀草素、黃芩素、β-谷甾醇等成分。槲皮素、木犀草素、黃芩素為黃酮類化合物。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫調節的作用[13]，實驗發現其能夠降低脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠TNF-α、IL-6水平，抑制過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性，即通過抑制炎癥與氧化應激的方式來防治急性肺損傷[14]，同時槲皮素對心臟也有保護作用[15]。木犀草素在體內外具有很強的抗炎活性[16]，能夠減少MAPL和NF-κB途徑的激活，抑制ICAM-1、TNF-α分泌，減弱肺部炎癥反應[17]；木犀草素對于甲型流感病毒誘導的肺內皮屏障功能障礙也有改善作用，能夠降低過高的肺通透性[18]。黃芩素具有抗菌、抗病毒的作用，能夠降低TNF-α、IL-6、MCP-1水平，增高IFN-γ、IL-10水平，從而治療甲型流感病毒誘導的急性肺損傷[19]。豆甾醇、β-谷甾醇都是植物甾醇類化合物，豆甾醇能減少嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的增殖，減輕細支氣管、肺泡炎性細胞的浸潤[20]。β-谷甾醇能夠抑制TGF-β1誘導的肺泡上皮細胞上皮-間質轉化，具有抗肺纖維化的作用[21]。

藿樸夏苓湯的作用靶點PPI網絡模塊化分析結果顯示，其主要涉及4個模塊。免疫細胞大量分泌細胞因子及趨化因子，能夠導致細胞因子風暴的啟動[22]，模塊1中的靶點包含促炎性因子TNF、IL-1B、IL-2、IL-6[23-24]，趨化因子CCL2、CXCL8、CXCL10[25]及抗炎性因子IL-4、IL-10[26-27]，通過對其調節能夠改善體內的細胞因子風暴。MMP2、MMP3、MMP9等基質金屬蛋白酶在白細胞的遷延中起重要作用，能夠介導細胞因子的分泌，加劇細胞因子風暴[28]。細胞因子風暴還能加劇肺組織上皮細胞和肺血管內皮細胞損傷，EGF、EGFR、VEGFA等生長因子能夠促進細胞增殖，加之VCAM1的黏附作用有助于內皮屏障的重建，改善急性肺損傷[29]。PPARG能夠改善流感病毒誘導的細胞因子風暴中炎癥反應[30]；模塊2的靶點主要為阿片受體、乙酰膽堿受體、多巴胺受體等。阿片類受體激動能夠減輕脂多糖誘導的肺損傷，改善急性呼吸窘迫綜合征[31]。乙酰膽堿受體功能的降低會增加乙酰膽堿的釋放和氣道高反應性，加強炎癥因子的刺激[32]。多巴胺受體激動能夠通過抑制YAP/TAZ治療肺纖維化[33]；模塊3的靶點主要為腎上腺素能受體、胺氧化酶。腎上腺素能受體激動能夠抑制炎性因子經氣道釋放，減輕肺部炎癥，改善肺組織微循環障礙[34]。胺氧化酶能夠調節白細胞滾動速度及遷移效率，減緩肺纖維化損傷[35]；模塊4的靶點包含多種酶與轉錄因子，能夠參與細胞周期的調控。

關鍵靶點的GO功能富集分析顯示，生物過程涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、脂多糖介導的信號通路、DNA模板轉錄的正調控、脂多糖的細胞反應、炎癥反應、蛋白激酶B信號傳導等，細胞組成涉及核質、頂端質膜等，分子功能涉及轉錄因子結合、蛋白磷酸酶結合、染色質結合、轉錄調控區DNA結合、血紅素結合、轉錄激活RNA聚合酶II核心啟動子近端區序列特異性結合活性等。KEGG通路富集分析顯示，涉及甲型流感、百日咳、非小細胞肺癌等疾病通路，腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等信號通路。SARS-CoV-2作為RNA病毒，通過調控RNA聚合酶II啟動子的轉錄，能夠影響病毒RNA的復制[36]。脂多糖是常見的炎癥觸發因素[37]，能夠引起內皮細胞凋亡，誘發肺組織炎癥、肺間質水腫，出現呼吸困難和低氧血癥造成急性肺損傷[38]，因此通過對脂多糖相關因素的調控，能夠改善肺炎癥反應及減少肺損傷。通路富集分析發現，前20條通路中肺相關疾病的條目較多,顯示靶點對肺相關疾病的作用較明顯。Toll樣受體作為信號分子模式識別受體，主要參與非特異性免疫，是對抗病毒的第一道防線，其還參與肺纖維化的發生發展[39]。NOD樣受體信號通路同樣作為機體固有免疫系統的一部分，參與免疫應答，介導炎癥反應[40]。腫瘤壞死因子信號通路是炎癥反應中的重要通路，對抑制細胞因子風暴起著重要作用[41]。HIF-1信號通路在機體低氧的應答中起重要作用，能夠改善缺氧表現[42]，對于該信號通路的調控還能抑制肺纖維化[43]。MAPK信號通路在急性肺損傷、肺纖維化進程中也起到調節作用[44-45]。

綜上所述，本次研究通過網絡藥理學分析發現，藿樸夏苓湯通過多成分、多靶點發揮著抗炎、免疫調節、抗肺纖維化的作用，通過腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路等多通路起到對COVID-19的治療作用，這為藿樸夏苓湯更廣泛地應用于治療COVID-19提供了理論依據。