背部推拿手法對亞急性衰老并免疫功能低下家兔血清免疫細胞與免疫球蛋白的影響研究?

王之虹，楊寄禹，劉明軍，卓 越，楊寄渝，于明超，尚 坤，張 欣

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

宋代醫(yī)學著作《圣濟總錄》中記載推拿按摩可以“斡旋氣機，周流營衛(wèi)、宣搖百關、疏通凝滯”，能夠使人“耳目聰明，身體輕強，老者復壯，壯者復治”[1]。項目組據此提出“推拿手法能夠改善機體免疫功能”的說法，以亞急性衰老并免疫功能低下的家兔模型為研究對象，以背部推拿手法為干預手段，通過觀察家兔體質量、血清免疫細胞與免疫球蛋白的變化情況加以驗證，獲得滿意結論。

1 材料

1.1 實驗動物

純種新西蘭大耳家兔36只(長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(吉)2016-0004)，兔齡4個月，體質量(1950±210)g。采用隨機數字表法將家兔分為空白組、模型組、藥物組、推拿組4組。其中空白組、模型組家兔各6只，藥物組、推拿組家兔各12只。所有家兔分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房間光線充足、通風良好，溫度保持在18～25 ℃左右，相對濕度保持在50%～70%左右。本實驗已通過長春中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 實驗藥品

環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H32020857)；免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、酶聯免疫試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，貨號ML027242、ML027243)；補體3(Complement 3，C3)、補體4(Complement 4，C4)酶聯免疫試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，貨號ML027351、ML027854)；免疫細胞分化簇3(cluster of differentiation，CD3+)、輔助性T細胞(cluster of differentiation 4，CD4+)、細胞毒性T細胞(cluster of differentiation 8，CD8+)、自然殺傷細胞(atural killer cell，NK)酶聯免疫試劑盒(美國貝克曼庫爾特商貿中國有限公司，貨號ML773220、ML762221、ML774302、ML778201)。

1.3 實驗儀器

推拿手法測定儀(上海益聯醫(yī)學發(fā)展有限公司，TAP-Ⅱ型)；血細胞檢測儀(i-STAT300型，美國雅培公司)；低速離心機(TL80-1型，江蘇天力醫(yī)療器械有限公司)；酶標儀(SM600型，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)；體液免疫檢測儀(DXI 800型，美國貝克曼公司)。

2 方法

2.1 動物模型的制備

采用環(huán)磷酰胺腹腔注射的方法造模。以60 mg/(kg.d)的標準計算每日注射量，連續(xù)開展腹腔注射4次，隔日注射1次。空白組注射等量生理鹽水。造模結束后，動物出現精神狀態(tài)差、飲食少、脫毛、眼屎、鼻腔分泌物增多、體質量下降等現象，表明造模成功。

2.2 動物模型的處理

空白組動物每天抓取1次，不做其他處理。模型組、推拿組、藥物組動物每天抓取1次，隔日給予腹腔注射造模。造模結束第2天，推拿組動物開始推拿干預，藥物組動物開始口飼藥物。推拿和服藥時家兔不固定以避免驚嚇。

2.3 干預方法

2.3.1 背部推拿手法干預 推拿部位：實驗動物背部足太陽膀胱經循行路線，肺俞穴至腎俞穴間部分[2]。

操作方法：直推法：術者一手扶持家兔，另一手拇食指分別置于家兔脊柱兩側，從頭至尾的方向進行推法操作。操作時手指指腹緊貼局部皮膚，推進速度適中，手法力度經推拿手法測試儀測定約為0.5 kg，時間約3 min；按揉法：術者一手扶持家兔，另一手拇指置于脊柱一側，指腹著力，從頭至尾的方向進行按揉法操作，重點按揉肺俞穴、心俞穴、肝俞穴、脾俞穴、腎俞穴。操作時指腹緊貼局部皮膚，順時針方向，揉動速度適中，手法力度經推拿手法測試儀測定約為0.5 kg，時間約5 min；捏脊法：助手固定家兔，術者以雙手拇食指指腹部提捏家兔脊柱兩側皮毛及皮下組織，從尾至頭的方向進行捏脊法操作。操作時移動速度適中，提捏力度經推拿手法測試儀測定約為0.5 kg，反復操作10次。背部推拿手法干預每天1次，每次約10 min左右，連續(xù)干預21 d。

2.3.2 藥物干預 干預藥物黃芪精口服液(揚子江藥業(yè)集團有限公司生產，國藥準字Z32021206)。干預方法：口飼劑量為30 g/kg·d，連續(xù)口飼21 d。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 觀察指標 觀察不同組別實驗動物干預前后體質量差值，觀察不同組別實驗動物血清免疫細胞CD3+、CD4+、CD8+、NK含量，觀察不同組別實驗動物的外周血IgM、IgG含量。

2.4.2 檢測方法 分別于干預前后稱取實驗動物體質量。干預結束后第2天麻醉實驗動物，耳緣靜脈取血，一部分血液抗凝、離心，取血清以酶聯免疫吸附法測定血清CD3+、CD4+、CD8+、NK含量。另一部分血液抗凝，采用免疫檢測儀檢測 IgM、IgG含量。

3 結果

3.1 不同組別實驗動物干預前后體質量差值

表1示，推拿組和藥物組家兔在干預前后的體質量差值均高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 不同組別實驗動物干預前后體質量差值影響比較

注：與空白組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05

3.2 不同組別實驗動物血清免疫細胞含量

表2示，推拿組與藥物組家兔在干預后的血清免疫細胞CD3+、CD4+、NK的含量均高于模型組，CD8+的含量均低于模型組，其中CD3+、NK、CD8+含量差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 不同組別實驗動物血清免疫細胞含量比較

注：與空白組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05，★★P<0.01

3.3 實驗動物干預前后外周血IgM、IgG含量比較

表3示，推拿組與藥物組家兔在干預后的外周血IgM、IgG含量均高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 不同組別實驗動物外周血IgM、IgG含量比較

注：與空白組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05，★★P<0.01

4 討論

背部推拿手法是項目組結合臨床工作經驗與經典醫(yī)籍發(fā)掘成果總結提煉形成，通過在機體背部足太陽膀胱經循行部位開展推法、按揉法、捏脊法等推拿手法操作，達到疏通經絡、行氣活血、調和營衛(wèi)、固表衛(wèi)外等目的，從而發(fā)揮調節(jié)機體免疫功能的作用[3]。從中醫(yī)理論講，足太陽膀胱經“主人體一身之表”，具有密肌固表的功效；其循行路線上分布的肝俞、心俞、脾俞、肺俞、腎俞等背俞穴也具有調節(jié)五臟功能、平衡機體陰陽的作用。同時，足太陽膀胱經在十二經脈中分布最長最廣，是人體的“藩籬”。太陽為諸陽之首，在三陽經中陽氣最盛，陽氣充足，人體抵抗外邪的能力就強，換言之機體免疫功能增強[4]。

通過本研究的結果可見，背部推拿手法增加了免疫抑制家兔干預前后體質量差值，表明有效改善了其身體狀態(tài)，側面證實背部推拿手法對免疫功能的調節(jié)作用。同時，背部推拿手法能夠有效增加免疫抑制家兔CD3+、CD4+、NK含量，降低CD8+含量，增加外周血IgM、IgG含量，直接證實背部推拿手法對免疫功能的調節(jié)作用。

血清免疫細胞是機體發(fā)生免疫應答的重要基礎之一，其中CD3+細胞是成熟淋巴細胞，也是細胞免疫中最主要的活性細胞，是構成T細胞抗原受體的膜抗原，參與免疫信號向細胞內的傳達；CD4+細胞是輔助性T細胞，主要作用是增強吞噬細胞介導的抗感染作用，調節(jié)其他T細胞免疫應答，促進B細胞分泌抗體以增強體液免疫應答[5]；CD8+細胞在特異性免疫反應中起識別和呈遞抗原的重要作用，主要針對細胞毒效應，發(fā)揮細胞毒性T細胞功能；NK細胞是機體重要免疫細胞，是天然免疫和特異性體液免疫中的效應細胞，可合成和分泌多種細胞因子，發(fā)揮免疫強化和造血作用以及直接殺傷靶細胞，在調節(jié)機體免疫功能方面具有重要作用[6]。免疫球蛋白是存在于機體體液中的一類糖蛋白，由B細胞收到抗原刺激后分化生成，是介導機體體液免疫的主要效應分子。IgM是機體首次發(fā)生免疫應答時所產生的抗體，在機體免疫系統中占有重要的免疫防御地位；IgG在體液內含量很高，廣泛分布，在機體再次免疫應答中發(fā)揮重要作用，是主要的抗體之一[7]。本研究藥物組采用的藥物黃芪具有健脾益氣、升陽舉陷、益衛(wèi)固表等功效，自古便有“補藥之長”說法[8]。本研究結果顯示，背部推拿手法對免疫抑制家兔免疫細胞CD3+、CD4+、NK和免疫球蛋白IgM的提升作用，略高于口飼黃芪精口服液，體現了良好的改善免疫功能作用。同時，背部推拿手法操作簡便、安全、舒適、無毒副作用，更凸顯了臨床推廣的優(yōu)勢。

綜合以上研究可見，背部推拿手法能夠改善和調節(jié)機體免疫功能，其可能的作用機制是通過調節(jié)機體的細胞免疫和體液免疫功能來實現。本研究結論將為推拿療法的作用機制研究開辟新的思路與方法，也為推拿療法應用于養(yǎng)生保健和養(yǎng)老康復等大健康產業(yè)奠定實驗室基礎。