柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠模型胃腸平滑肌細(xì)胞MLCK表達(dá)的影響?

彭 雷，程闊菊，朱 丹，羅 云△，程 俊

(1.四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 四川 達(dá)州 635000；2.西南醫(yī)科大學(xué)心肌電生理研究室, 四川 瀘州 646000)

大量臨床和基礎(chǔ)研究已證實(shí)，柴胡疏肝散能顯著改善胃腸功能紊亂，主要表現(xiàn)為改善胃腸運(yùn)動(dòng)功能[1-2]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。平滑肌細(xì)胞是胃腸運(yùn)動(dòng)功能的執(zhí)行細(xì)胞，而Ca2+-CaM-MLCK是平滑肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控系統(tǒng)中的第二信號(hào)系統(tǒng)，在調(diào)控平滑肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中起著主要作用[3]。那么柴胡疏肝散有沒(méi)有可能通過(guò)Ca2+-CaM-MLCK信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮作用，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究擬選擇Ca2+-CaM-MLCK的下游靶點(diǎn)肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)為研究點(diǎn)，觀察柴胡疏肝散湯劑對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞MLCK表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供(合格證號(hào)SCXK(川2008-24)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要設(shè)備與試劑

柴胡疏肝散各味藥材，購(gòu)自達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房(均附鑒定證書(shū)和合格證書(shū))；利血平(天津金耀藥業(yè)有限公司(批號(hào)1501161)；LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche)；一抗，MLCK、β-actin(abcam)；熒光二抗、DAPI(谷歌生物)；LightCycler480(Roche)，Odyssey 掃描成像系統(tǒng)(LICOR,USA)；倒置熒光顯微鏡(Leica,Nikon Eclipse Ti-SR)；切片機(jī)(Leica,Leica UC7)；鉆石切片刀(Daitome,Ultra 45°)。

2 方法

2.1 藥物制備

柴胡疏肝散湯劑組成：陳皮、柴胡各120 g，川芎、枳殼(麩炒)、芍藥各90 g，甘草(炙)30 g，香附90 g。藥材經(jīng)清洗后溫水1000 ml浸泡1 h，后煎煮30 min，提取2次，再合并水煎液，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型制備及分組

實(shí)驗(yàn)分組取雄性SD大鼠80只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組(對(duì)照組)、FGID組(模型組，F(xiàn)GID：functional gastrointestinal disorders)、sham+柴胡疏肝散組、FGID+柴胡疏肝散組4組各20只。為觀察柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠胃腸功能是否有不良影響，本研究設(shè)計(jì)了sham+柴胡疏肝散組。

模型制備：FGID組參考王曉燕的方法[4]，按照0.5 mg/kg·d的劑量連續(xù)腹腔注射利血平14 d。sham組給予模型組利血平同等劑量的生理鹽水。

給藥劑量及途徑選擇根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，藥物組按照每只大鼠30 ml/Kg/d的柴胡疏肝散湯劑劑量，分2次早晚灌服大鼠，與造模同時(shí)進(jìn)行，與利血平腹腔注射時(shí)間間隔2 h，對(duì)照組給予等量滅菌注射用水灌胃。

2.3 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

根據(jù)人類(lèi)胃腸功能紊亂的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合大鼠的生物學(xué)特性，國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的大鼠胃腸功能紊亂動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，主要包括胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙和病理組織學(xué)表現(xiàn)兩個(gè)方面[3-4]。

2.3.1 胃腸運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè) 包括胃腸生物電檢測(cè)、胃排空實(shí)驗(yàn)和小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)。

(1)胃腸生物電檢測(cè)：參照文獻(xiàn)[2]的方法，大鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉后仰臥位固定，劍突下腹部正中切口暴露胃和小腸。在胃竇距離幽門(mén)0.5 cm處的漿膜下安放一對(duì)銀絲電極，在距屈氏韌帶1 cm處的小腸對(duì)系膜漿肌層內(nèi)安置一對(duì)銀絲電極。固定電極，關(guān)閉腹腔，電極另一端連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，時(shí)間常數(shù)5 s，高頻率波30 Hz，增益2000。預(yù)適應(yīng)30 min后以每10 min為一個(gè)時(shí)間段，分別記錄大鼠胃、小腸的在體慢波，連續(xù)記錄80 min。計(jì)算每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每個(gè)時(shí)間段的慢波頻率、振幅、慢波頻率變異系數(shù)和慢波振幅變異系數(shù)。

(2)胃排空實(shí)驗(yàn)：從第14天晚開(kāi)始禁食不禁水至第16天早8點(diǎn)，共計(jì)36 h。給予事先配制好的營(yíng)養(yǎng)半固體飲食3 mL，30 min后用戊巴比妥麻醉，打開(kāi)腹腔結(jié)扎幽門(mén)和賁門(mén)，腹主動(dòng)脈放血后取胃，清除胃表面血漬，稱(chēng)重計(jì)量為M1，剪開(kāi)胃體，清除胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分稱(chēng)重為M2，計(jì)算胃殘留率：(M1-M2)/所灌半固體飲食質(zhì)量×100%。

(3)小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[2]方法，用絲線結(jié)扎胃幽門(mén)和小腸回盲部，分離腸系膜，測(cè)量幽門(mén)至回盲部的距離作為小腸的總產(chǎn)度計(jì)為L(zhǎng)1，幽門(mén)至小腸營(yíng)養(yǎng)湖黑染的距離作為小腸推進(jìn)的長(zhǎng)度計(jì)為L(zhǎng)2，計(jì)算小腸推進(jìn)率=(L1-L2)/L1×100%。

2.3.2 組織病理學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠胃竇組織、小腸中段1.5 cm，用生理鹽水洗凈胃腸內(nèi)容物，迅速將組織置于固定液(4%多聚甲醛)中固定2 h，常規(guī)乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木素-伊紅染色、脫水、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)并照相并記錄。

2.4 免疫熒光檢測(cè)

待胃運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)結(jié)束后，剝離出大鼠胃竇和結(jié)腸肌層，經(jīng)丙酮固定，常規(guī)乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片、脫蠟，抗原修復(fù)，畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅，血清封閉，加一抗、二抗，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光淬滅劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.5 Western blot檢測(cè)

胃腸肌層組織粉粹研磨同上，組織研磨結(jié)束后每EP管加入1 ml 預(yù)冷的RIPA buffer 裂解液，置冰上用超聲裂解儀充分裂解組織，于4°下12000r/min 離心30 min，收集上清液即為細(xì)胞的總蛋白溶解液。利用BCA Protein Assay Kit 對(duì)蛋白濃度定量后，根據(jù)濃度加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，10×DTT，95 ℃水浴5 min，使蛋白變性。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，后續(xù)加入MLCK、β-actin(rat)一抗及相應(yīng)的二抗。采用Odyssey 掃描成像系統(tǒng)(LICOR,USA)對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

2.6 Real-Time PCR 檢測(cè)

表1示，待胃腸運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)結(jié)束后剝離胃竇和結(jié)腸黏膜，將肌層組織迅速放入經(jīng)液氮預(yù)冷的無(wú)酶EP管(預(yù)先已放入研磨珠子)中，在研磨器中對(duì)組織進(jìn)行充分粉粹研磨。研磨結(jié)束后，向EP管中加入1 ml Tripure Isolation Reagent，然后按照其說(shuō)明書(shū)提取RNA，接著按照Transcriptor First Stand c DNA Synthsis Kit說(shuō)明書(shū)將RAN 反轉(zhuǎn)成cDNA。然后于LightCycler? 480儀器上應(yīng)用LightCycler 480 SYBR Green I Master對(duì)MLCK進(jìn)行Real-time PCR相對(duì)定量分析，內(nèi)參為β-actin，Real-time PCR引物序列。

表1 MLCK、β-actin Real-time PCR引物相關(guān)信息比較

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠胃腸功能紊亂動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

表2圖1示，造模結(jié)束后模型組胃腸運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)為胃腸慢波頻率及振幅顯著下降(胃腸生物電檢測(cè))(P<0.05)，胃排空顯著減慢(胃殘留率增多)(P<0.05)，小腸推進(jìn)率明顯降低(P<0.05)；給予柴胡疏肝散處理后，胃腸慢波頻率及振幅顯著上升(P<0.05)，胃排空顯著加快(P<0.05)，小腸推進(jìn)率明顯加快(P<0.05)，胃腸道組織病理學(xué)表現(xiàn)為無(wú)器質(zhì)性病變。根據(jù)模型組大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)和組織病理學(xué)表現(xiàn)，可判定模型制作成功。

表2 大鼠胃腸功能紊亂動(dòng)物模型胃腸運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)

注：與sham組比較：*P<0.05；與FGID組比較：#P<0.05

注：sham:對(duì)照組；sham +藥物:sham+柴胡疏肝散組;FGID:大鼠胃腸動(dòng)物功能紊亂模型組; FGID+藥物：FGID+柴胡疏肝散組

注：sham:對(duì)照組；sham +藥物:sham+柴胡疏肝散組;FGID:大鼠胃腸動(dòng)物功能紊亂模型組; FGID+藥物：FGID+柴胡疏肝散組

3.2 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠結(jié)腸肌層MLCK免疫熒光的影響

圖2示，熒光顯微鏡下觀察，正常大鼠(sham組)胃竇和結(jié)腸肌層內(nèi)可見(jiàn)均勻的MLCK陽(yáng)性表達(dá)，sham+柴胡疏肝散組與sham組相似，F(xiàn)GID組MLCK陽(yáng)性表達(dá)顯著減少，F(xiàn)GID+柴胡疏肝散組中MLCK陽(yáng)性表達(dá)較FGID組顯著增多。

3.3 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃腸平滑肌MLCK蛋白表達(dá)的影響

圖3示，模型組大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLCK的蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05)；柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLCK的蛋白表達(dá)量無(wú)影響(P≥0.05)，但可顯著上調(diào)胃腸功能紊亂大鼠胃腸道MLCK的蛋白表達(dá)量(P<0.05)。

注：與sham組比較：*P<0.05；與FGID組比較：#P<0.05

3.4 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃腸平滑肌MLCK的 mRNA表達(dá)量影響

圖4示，模型組大鼠胃竇、結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLCK的mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)；柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠胃竇、結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLCK的mRNA表達(dá)量無(wú)影響(P≥0.05)；但可顯著上調(diào)胃腸功能紊亂大鼠胃竇、結(jié)腸MLCK的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

4 討論

胃腸功能紊亂是一種臨床常見(jiàn)的非器質(zhì)性功能性胃腸道疾病，以胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙為主，臨床表現(xiàn)為無(wú)器質(zhì)性病變的腹瀉、便秘、腹痛等消化系統(tǒng)癥狀，發(fā)病率約為40%，約占胃腸道疾病的40%～60%，并呈逐年上升趨勢(shì)[5]，其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，臨床缺乏有效的化學(xué)藥物。臨床和基礎(chǔ)研究顯示，柴胡疏肝散能顯著改善胃腸功能紊亂癥狀[1-2]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。隨著中醫(yī)藥逐步走向國(guó)外，更多的國(guó)外學(xué)者要求中醫(yī)藥能提供現(xiàn)代的科學(xué)理論依據(jù)。

《景岳全書(shū)·古方八陳·散陳》云：“肝喜條達(dá)，主疏泄而藏血，其經(jīng)脈布脅肋，循少腹”，因情志不遂、木失條達(dá)、肝失疏泄而致肝氣郁結(jié)。多項(xiàng)研究指出，胃腸功能紊亂與肝失疏泄、脾失健運(yùn)關(guān)系最為密切[6-8]。功能性消化不良的基本病機(jī)為肝郁犯脾、脾虛氣滯，只有堅(jiān)持疏肝理氣、健脾燥濕，才能很快消除致病之根源，使臨床癥狀減輕[9]。《素問(wèn)·六元正紀(jì)大論篇》亦云:“木郁達(dá)之”，治宜疏肝理氣之法。柴胡疏肝散由“醋炒陳皮、柴胡各二錢(qián)，川芎、麩炒枳殼、芍藥各一錢(qián)半，炙甘草五分，香附一錢(qián)半”組成，功效疏肝理氣止痛[10]。方中柴胡疏肝解郁為君藥；香附理氣疏肝，助柴胡解肝郁；川芎行氣活血而止痛，助柴胡以解肝經(jīng)之郁滯，二藥相合增其行氣止痛之功為臣藥；陳皮、枳殼理氣行滯；芍藥、甘草養(yǎng)血柔肝、緩急止痛為佐藥，諸藥相合共奏疏肝行氣、活血止痛之功，主治肝氣郁滯證，使肝氣條達(dá)，血脈通暢，營(yíng)衛(wèi)自和。

現(xiàn)代藥理認(rèn)為，胃腸舒縮運(yùn)動(dòng)由胃腸道平滑肌細(xì)胞執(zhí)行，在平滑肌細(xì)胞內(nèi)控制其舒縮運(yùn)動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)2條途徑，其中以MLCK途徑為主[3]。當(dāng)平滑肌細(xì)胞受到刺激引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加時(shí)，游離的Ca2+與CaM結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，該復(fù)合物靠近MLCK，誘導(dǎo)MLCK發(fā)生構(gòu)象改變激活MLCK，激活的MLCK使肌球蛋白第19位的絲氨酸或第18位的蘇氨酸同時(shí)磷酸化，肌球蛋白磷酸化后引起自身伸展，其后頭部的ATP酶活化釋放能量使肌絲滑動(dòng)，導(dǎo)致平滑肌收縮最終引起胃腸道收縮[11]。相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低時(shí)胃腸道舒張，可見(jiàn)主要是Ca2+-CaM-MLCK信號(hào)通路操縱著胃腸平滑肌細(xì)胞的舒縮狀態(tài)，進(jìn)而操縱著胃腸道的舒縮功能。MLCK作為該信號(hào)通路的下游蛋白，可直接或間接反映該信號(hào)通路的活化狀態(tài)，因此該信號(hào)通路多以MLCK為研究靶點(diǎn)。

本研究利用腹腔注射利血平制備胃腸功能紊亂大鼠模型，胃運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)為慢波頻率及振幅下降，使胃排空減慢。利用Real-Time PCR、Westeron Blot、組織免疫熒光技術(shù)顯示，在模型組大鼠的胃竇和結(jié)腸肌層平滑肌細(xì)胞中，MLCK的表達(dá)顯著減少，應(yīng)用柴胡疏肝散干預(yù)后MLCK表達(dá)顯著增多，同時(shí)胃腸運(yùn)動(dòng)功能也得到顯著改善。但柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能、組織病理學(xué)、胃竇和結(jié)腸肌層平滑肌細(xì)胞中MLCK的表達(dá)無(wú)影響。

本研究證明，柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠無(wú)作用，但可顯著改善大鼠胃腸功能紊亂動(dòng)物模型中胃腸運(yùn)動(dòng)功能，為臨床安全應(yīng)用提供了部分可靠的科學(xué)依據(jù)。就其現(xiàn)代機(jī)制研究認(rèn)為，其中之一為調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLCK的表達(dá)。郁怒傷肝，木不疏土，可致脾胃運(yùn)化失調(diào)，而柴胡疏肝散則通過(guò)調(diào)控胃腸道MLCK的表達(dá)量，治療胃腸功能紊亂和肝疏泄失調(diào)的表現(xiàn)，對(duì)于其余機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。