胡文梅，賈愛明，白長川

(1.大連醫科大學中山學院實驗中心，遼寧 大連 116085；2.大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧 大連 116023；3.大連市中醫醫院，遼寧 大連 116013)

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)能夠導致肢端疼痛和感覺遲鈍，引發神經性潰瘍和截肢。目前關于糖尿病周圍神經病變并沒有客觀有效的治療方法，中醫藥防治DPN越來越得到關注。有研究表明，糖尿病是一種缺氧性疾病[1]，而周圍神經血流的減少以及隨之而來的組織缺氧與DPN發生發展密切相關。關于糖尿病周圍神經病變與高糖、缺氧有關，課題組雖已有部分基礎研究[2]，發現當歸四逆湯有改善DPN作用，而在高糖缺氧誘導下影響血管新生的具體機制涉及許多分子及信號通路，其中微小RNA-210(miR-210)、HIF-1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)對血管新生可能的調控途徑及機制尤其值得進一步研究?；诖?，本實驗通過預防性用藥探討當歸四逆湯對糖尿病大鼠坐骨神經miR-210、HIF1-α和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的影響，以期為臨床用藥提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠30只，6周齡左右，體質量(200±20)g，購于遼寧長生生物技術有限公司。喂養環境溫度(22±3)℃，濕度50%，明暗交替12 h。實驗經大連醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準(編號2016-9)，動物福利按照國際相關實驗動物法規實施。

1.2 主要設備和試劑

當歸四逆湯方藥，購自大連醫科大學附屬第二醫院藥劑科；VEGF-A多克隆抗體、巴傲得、辣根酶標記山羊抗兔IgG，中杉金橋；濃縮型DAB試劑盒，中杉金橋；鏈脲佐菌素(STZ)、Sigma均購自大連欣華生物；RNAiso Plus，9108，Takara，TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus),RR820 A、Takara，均購自艾科瑞生物工程有限公司；泰盟牌熱刺痛儀PL-200型，成都泰盟科技有限公司；生物機能實驗系統BL-420F型，成都泰盟科技有限公司；多功能顯微鏡BX51型，OLYMPUS公司；PCR儀TP600型，寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 糖尿病大鼠模型建立及分組

30只大鼠適應性喂養1周后禁食12 h，除空白對照組大鼠8只按5 ml/kg 腹腔注射檸檬酸緩沖液外，其余大鼠腹腔注射1%的STZ(PH4.4的0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液配制)50 mg/kg。72 h后尾靜脈取血后用血糖儀測定血糖，隨機血糖>16.7 mmol/L的大鼠被確定為糖尿病模型造模成功。隔日1次監測血糖，血糖過高的大鼠注射胰島素，以控制觀察組大鼠血糖在相似水平(血糖監測至實驗結束)。監測血糖1周，造模失敗2只剔除實驗。可能因血糖過高死亡1只，2只因血糖回落剔除實驗。最終造模成功大鼠17只，采用隨機數字表法分為2組，其中糖尿病模型組8只，中藥預防組9只。

1.4 給藥方法

自造模成功1周后起，中藥預防組每日灌服1次當歸四逆湯(由大連醫科大學附屬第二醫院藥劑科煎制，每毫升含生藥2.2 g)。每日測體質量后按12 ml/(kg·d)劑量給藥，灌胃至12周結束。其余組按12 ml/(kg·d)灌服蒸餾水，每周更換1次灌胃針以保護大鼠。中藥預防組大鼠因灌胃不當死亡1只。

1.5 大鼠足底光熱刺激痛閾時間測定

造模成功后第12周結束后，測定大鼠足底光熱刺激痛閾時間。點亮刺激光源后預熱1 min，并設置實驗停止時間為30 s，光照強度為50%。將大鼠置于上層方格內，待大鼠靜息后移動下層的熱源輻射檢查箱，使熱源發射孔對準大鼠左前足底正中心位置，按動發射鍵，主機自動計時，大鼠抬腳后計時自動停止。選取同一只大鼠的左后及右后足底，再次測定2次，取3次平均值。

1.6 大鼠坐骨神經傳導速度測定

參考文獻[3]，造模成功后第12周結束后，分別測定各組大鼠坐骨神經傳導速度。

1.7 免疫組化

12周結束，一次性腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠后，俯臥位固定,取左側梨狀肌下緣坐骨神經約1 cm，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水,石蠟包埋,連續切片片厚約3 μm，烤干后4 ℃保存，留做免疫組化。3%H2O2滅活內源性過氧化物酶20 min后，CB緩沖液水浴修復抗原。滴加山羊血清封閉液，于室溫孵育15 min后甩去多余液體，勿洗；滴加稀釋的VEGF抗體(工作濃度均為1∶50)，置濕盒中37 ℃孵育1 h，4℃過夜；復溫至37 ℃，PBS洗3 min/次×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min,PBS洗3 min/次×3 次；滴加辣根酶標記鏈親合素(SABC)，置濕盒中37 ℃孵育30 min，PBS洗3 min/次×3 次；DAB顯色，顯微鏡下控制反應時間，有表達后蒸餾水洗5 min/次×3次以終止反應；80%、90%、95%、100%乙醇依次梯度脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。分別以PBS 抗體緩沖液代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下照相，應用Image-Pro Plus軟件測定免疫反應產物蛋白的集成光密度值。

1.8 Real Time PCR

提取RNA作為模板合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。miR-210(71 bp)上游引物GGAGATCTGACCAGGTCATTTGCATAC;下游引物GGGAATTCGATATGACCACACC TGTG，U6(78 bp)為內參：CGCAAGGATGACACGCAAAT; HIF-1α(119 bp)上游引物TCTAGTGAACAGGATGGAATGGAG，下游引物TCGTAACTGGTCAGCTGTGGTAA，β-actin(150 bp)上游引物GGAGATTACTGCCCTGGCTC CTA，下游引物GACTCATCGTACTCCTGC TTGCTG。應用SYBR Green I熒光染料嵌合法，以空白對照組樣品提取的Total RNA(500 ng/μl)反轉錄獲得的cDNA作為標準品，分別制作U6、β-actin基因和miR-210、HIF-1α基因的標準曲線。將各組樣品(100 ng)分別在U6、β-actin基因和miR-210、HIF-1α基因標準曲線上進行定量實驗，并進行目的基因的相對表達量分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 12周各組大鼠空腹血糖、熱痛覺、坐骨神經傳導速度比較

表1示，與BC組比較，DM組大鼠血糖升高(P<0.05)，足底光熱刺激痛閾時間增長(P<0.05)，大鼠坐骨神經傳導速度減慢(P<0.05)。與DM組比較，MP組血糖差異無統計學意義(P>0.05)，足底光熱刺激痛閾時間縮短(P<0.05)，大鼠坐骨神經傳導速度增快(P<0.05)。

2.2 12周各組大鼠坐骨神經組織內VEGF表達比較

圖1表1示，各組大鼠坐骨神經的中小神經元細胞、神經膜、軸突和髓鞘中均可見到VEGF陽性細胞。VEGF的免疫組化表達經IPP圖像分析，計算IOD值。

圖1 各組大鼠坐骨神經組織內VEGF免疫組化表達

表1 大鼠空腹血糖、足底光熱刺激痛閾時間、坐骨神經傳導速度、VEGF蛋白表達平均積分光密度值及miR-210、HIF-1αmRNA水平比較

注：與空白對照組比較：#P<0.05；與糖尿病模型組比較：*P<0.05

2.3 12周各組大鼠坐骨神經miR-210、HIF-1αmRNA水平比較

表1示，與BC組比較，DM組miR-210、HIF-1αmRNA 水平降低(P<0.05)；與DM組比較，MP組miR-210、HIF-1αmRNA明顯增高(P<0.05)。

3 討論

本研究以中醫“孫絡-微血管”理論作為切入點，研究糖尿病周圍神經病變，不僅體現中醫特色，而且通過檢測HIF-1α、miR-210、VEGF等相關表達，使中醫宏觀脈絡理論與分子生物學的微觀世界相互聯系及印證，為經典方劑的開發提供理論依據。

“孫絡-微血管”作為維持脈絡末端營衛交會生化的基本功能單位，當其發生病變時可引發營衛交會生化異常，孫絡損傷不通成為多種脈絡病變的重要因素，且貫穿于脈絡病變的始終[4]。當歸四逆湯出自《傷寒論》，由當歸、桂枝、芍藥、細辛、甘草、通草、大棗組成，具有養血祛寒通脈功能，正合DPN中醫病機。臨床治療血虛受寒、寒凝經脈、血行不暢之手足厥寒，以肌膚麻木不仁、疼痛、脈澀為主要癥狀，歸屬于孫絡病變，與DPN 臨床表現相符，臨床應用當歸四逆湯，可以較好地改善DPN癥狀。

基于糖尿病是一種缺氧性疾病，DPN機制研究熱點之一是聚焦于微血管病變，認為微血管病變導致神經纖維缺氧，是DPN最重要的原因之一，因此缺氧調節及血管再生相關指標尤其值得關注。VEGF是一種強效促進血管再生因子，特異性地作用于血管內皮細胞，能刺激內皮細胞增殖、遷移和體內血管的形成。HIF-1α是HIF-1介導的應對低氧細胞應答的關鍵因素，而HIF-1作為一種轉錄因子，在低氧條件下可通過促進VEGF 基因轉錄，在調節組織血管生成中發揮重要作用[5]。miR-210 在缺氧導致的血管生成及內皮細胞存活過程中也發揮著重要作用[6]。miR-210 的表達受缺氧誘導后，可調控缺氧反應相關基因的表達，提示miR-210 有可能成為診治包括缺血缺氧性損傷等多種疾病的新靶點，故本實驗選擇HIF-1α、miR-210、VEGF指標。

本研究以SD大鼠作為研究對象，結果顯示12周后當歸四逆湯中藥預防組血糖值與糖尿病模型組比較無明顯差異，但可以縮短大鼠足底光熱刺激痛閾時間，增加坐骨神經傳導速度，提升大鼠坐骨神經組織的VEGF表達水平，提示中藥預防治療可以調控VEGF功能，促進血管再生，并能提高HIF-1α、miR-210水平，因而推測其調節機制可能與HIF-1α-miR-210-VEGF通路有關，其機制可能如下。

Puissegur 等研究證實，miR-210 與HIF-1可形成一個前饋回路，提示miR-210 與HIF-1密切相關[7]。miR-210一方面受HIF-1α調控，另一方面可調控VEGF功能，促進血管生成。在細胞對缺氧反應中起中樞紐帶作用。VEGF水平與DPN密切相關，可能是引起不同組間熱痛覺和神經傳導速度出現差異的原因之一。與糖尿病模型組恰恰相反，中藥干預組VEGF水平和miR-210、HIF-1α都呈現出較高水平的表達，故推測當歸四逆湯抗DPN作用機制可能是通過調控HIF-1α—miR-210—VEGF通路實現的，即當歸四逆湯可上調HIF-1α，而HIF-1α進一步上調靶基因miR-210表達，進而增強VEGF表達，促進血管新生進而保護大鼠坐骨神經。同時在糖尿病模型組及中藥治療組中，2組大鼠血糖比較差異無統計學意義，考慮其改善DPN的機制與血糖控制的關系不大。我們還需認識到，當歸四逆湯干預DPN的這一通路的相關因素或其他分子通路仍需進一步研究。

通常為說明治療方法的有效性，實驗常要設置陽性對照試驗組，而本實驗設計中限于主客觀條件，未設置陽性對照藥物組，這樣造成實驗結果雖可說明該中藥方有效，但難以證明此療法優于或等效于目前其他藥物，是實驗設計缺陷，在日后進一步實驗中需考慮增設。

鑒于miR-210、HIF-1α在缺氧時表現的突出作用，我們可以預見，研發中醫藥調控miR-210、HIF-1α，極有可能成為治療缺氧性疾病包括糖尿病及其慢性并發癥的新靶點。