荷葉鐵線蕨的無菌條件下誘導原葉體

望雄英

（長江珍稀植物研究所，湖北 宜昌 443100）

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗采用的是成熟未開裂的荷葉鐵線蕨孢子，采自植物所溫室。

1.2 實驗方法

（1）無菌播種。利用75%酒精對收集的成熟且未裂開的孢子表面進行消毒，每次30s，然后進行5min0.1%的升汞（HgCl2）的消毒，利用無菌水進行5～6 次沖洗，表面水分的吸取采用無菌濾紙。然后放置在無菌環境中，利用經消毒的無菌鑷子將孢子夾起放置于培養基上方，立即將瓶蓋蓋好，并進行標記，置于培養箱中進行為5d 的暗培養，然后將其放置于培養室，調整培養溫度大約為（25±2）℃，光照度設定為2000～2500lx，光照每日12h。

本次實驗主要設計了培養基6 組，并以此為基礎設置2 個不同pH 的實驗組，pH 分別設置為5.8 與7.0，總計進行培養基實驗的有6 組。

表1 孢子萌發培養基

（2）孢子誘導。無菌條件下，向不同孢子體誘導基質中轉接孢子體，其直徑為0.5cm，每種培養基配置數量為10 瓶。培養溫度調整為大約（25±2）℃，光照調整為2000～2500lx，光照時間為每日16h。孢子體誘導基質是以無菌條件下，添加不同基質，其中基質設置了4 種配比，詳情如表2 所示。從表2 可見，基質為泥炭；珍珠巖=6：1 時誘導率最高，原葉體具有良好的長勢，且具有較高的誘導率，同其他不同基質培養的苗相比更加健壯，顏色呈鮮綠色。若河沙數量較多，則會降低原葉體誘導系數，苗徑較小，而且顏色呈黃色。

2 結果

2.1 孢子無菌萌發

在培養基上放置孢子進行培養，20d 后，出現顯著萌發現象，孢子吸收膨脹，從黃褐色向綠色轉變，27d 后，可以發現孢子呈綠色小蘑菇狀，即孢子體。

表2 基質對孢子誘導的影響

根據孢子萌發數量分析，培養基中，4 號和6 號孢子萌發率較其他培養基高，而且長勢良好，萌芽發展速度快，也就是采用單一激素6-BA 而且質量濃度是1.0mg/L 的環境中，孢子萌發狀況號，其中，6 號培養基中孢子萌發較4 號培養基更優，部分孢子體經過60d 的培養，僅有少部分的孢子會繼續成長，但是并不能夠分化出原葉體。盡管處于同一培養基中，但是往往存在不同發育階段的孢子體。

2.2 孢子體誘導

向不同孢子體誘導培養基中轉接直徑為1cm 的孢子體，經20d 培養后，可以發現孢子出現諸多小突起，經38d 培養后，可以發現蘑菇狀萌芽。

2.3 生根移栽

在無菌操作條件下，將誘導出的原葉體定期噴施無菌水和高溫消毒的液態培養基，經70d 培養后發現原葉根基位置幼根較多，生根過程中，幼苗越長越高且變粗，同時葉片數量越來越多，顏色也發生改變，最終呈完整且健壯的植株。在原葉體生長至大約3cm 高度時，可向培養室外移煉苗，并逐步馴化，一直到可以進行野外栽培。

3 討論

（1）荷葉鐵線蕨孢子的無菌萌發。本實驗中，各個培養基中的荷葉鐵線蕨的孢子萌發率超過90%，僅有少部分孢子可能由于培養基失水導致其無法吸水進行造成，均可以萌發。本研究中，采用由溫室中培養的荷葉鐵線蕨的孢子，均已經發育成熟但是并沒有裂開，可見有性生殖類型均正常，所有具有較高的萌發率。

無菌播種實驗中，pH 培養基包括2 種，也就是5.8 與7.0，通常采用pH 為5.8 的植物組織培養基，因為pH 為7.0 的培養基對于植物的生長不利。但是經實驗發現，荷葉鐵線蕨在pH 為5.8與pH 為7.0 的培養基中培養，萌發狀況無明顯差異，與此同時，萌發后具有顯著的孢子體生長狀況，未來孢子體根誘導和體誘導期間，生長狀況無明顯差異。在pH 為7.0 時，培養基具有良好的硬度，且液化難度較大，可以很好的支撐苗，所以可以考慮應用于荷葉鐵線蕨培養體系中，將pH 為7.0 應用其中。

經實驗發現，處于質量濃度是1.0mg/L 和單一激素6-BA 培養基中的荷葉鐵線蕨的孢子具有良好的萌發效果。

（2）不同生長調節劑對荷葉鐵線蕨孢子增殖與生根誘導的影響。以前人的研究為依據，本實驗主要采用了2 種植物激素，分別是NAA 和6-BA。結果顯示，荷葉鐵線蕨孢子體誘導影響因素有很多，其中以不同濃度的6-BA 為主，而NAA 無顯著影響。在6-BA 質量濃度是1.0mg/L 時，具有較高的誘導率，在pH 為7.0時，培養基具有良好的硬度，不容易液化，可以很好的支撐苗。所以，荷葉鐵線蕨孢子培養過程中，應加強對pH 為7.0 培養基培養的重視。相似誘導生根階段，大部分采取NAA，以往實驗中，主要通過NAA 對誘導生根并培養，但是不同于其他報道研究結果，本實驗主要通過無菌基質誘導生根，生根效果不佳。其可能與蕨類植物自身發育特點存在緊密聯系，此外，實驗階段溫度程度也是主要影響因素，為獲取顯著移栽效果，需進一步進行研究。

（3）活性炭影響著荷葉鐵線蕨組織培養。植物組織培養過程中，主要采取活性炭，添加活性炭可抑制或者加快離體生長速度。經實驗發現，添加活性炭可加快孢子生長速度和萌發速度，所以原葉體誘導過程中，添加活性炭會對生根抑制，原因如下：由于活性炭將質基由荷葉鐵線蕨生長代謝形成的有害物質吸出，對于孢子的萌發有利，而且可以加快孢子體生長速度，但是因為活性炭可以將部分營養物質吸出，所以生根培養過程中可利用高溫方式滅菌基質，但是具有較低的營養物質濃度。生根的苗營養物質需求量多，但是因為活性炭將部分營養物質吸出，導致其無法保證植物所需營養物質，所以進一步抑制了生根。