淫羊藿苷對藻酸鹽3D體外培養下小鼠軟骨細胞周期蛋白、β-catenin表達的影響

王鵬珍，熊喜峰，秦勝男，張金麗，李愛國

廣州市紅十字會醫院 廣州市創傷外科研究所，廣州510000

損傷關節軟骨的重塑和修復，需要足量、有活性的關節軟骨細胞[1,2]。關節軟骨是無血管和高度特異化的組織，內襯在活動關節表面。軟骨層可以降低關節面之間的摩擦，并可以起到緩沖減震、承載壓力的作用[3]。值得注意的是，關節軟骨一旦發生損傷，其固有的無血管、低細胞密度和低細胞遷移能力的特點都會限制軟骨組織的再生。如何獲得大量活性高、增殖能力強的軟骨細胞，在細胞治療關節軟骨損傷的過程中起關鍵作用[4,5]。文獻報道，適宜濃度的淫羊藿苷(ICA)可以顯著促進關節軟骨細胞增殖并提高細胞活性[2,6]；我們的前期研究中也發現，ICA在10-6μmol/L 時可以顯著促進原代小鼠關節軟骨細胞增殖[7]。但是，其具體作用機制尚不清楚。2019年3～12月，我們擬在軟骨細胞-藻酸鹽3D培養條件下，研究ICA對體外小鼠關節軟骨細胞增殖相關蛋白Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin表達的影響，旨在為ICA用于細胞工程治療骨關節炎提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 ICA購于北京北奧創新科技有限公司，批號為20090503，經HPLC測定ICA 含量不低于98%；出生2 d的C57BL/6雄性小鼠均購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號SCXK-2013-0002，本實驗設計及過程均符合本院動物倫理委員會規定。DMEM完全培養基，含10% 小牛血清、100 U/mL青/鏈霉素、20 mmol/L L-谷氨酰胺；Ⅰ型膠原酶(9001-12-1,Sigma)，D型膠原酶(11088866001,Roche)。抗兔HRP/DAB 免疫試劑盒批號(b64261,Abcama)，兔抗鼠β-catenin(sc-7963,Santa Cruz)，兔抗鼠Cyclin D1 (sc-2978,Santa Cruz)，兔抗鼠Cyclin E(sc-2925, Santa Cruz)；熒光定量PCR試劑盒TB Green Premix ExTaq Ⅱ (RR066A, Takara)，熒光定量PCR儀(qTOWER 2.2，Analytik Jena AG)。

1.2 實驗方法

1.2.1 軟骨細胞的分離和培養 參考本課題組前期文獻的操作方法[7]，取新生2 d的小鼠關節軟骨組織；用0.7 mg/mL的Ⅰ型膠原酶消化30 min，移入含0.7 mg/mL Ⅰ型膠原酶和3 mg/mL D型膠原酶的PBS混合液中，37 ℃消化6 h。用直徑180 mm的濾膜過濾消化下來的軟骨細胞，離心后用PBS洗3次，將細胞重懸在DMEM完全培養基中；在5% CO2、37 ℃條件下培養，每3 d換液1次[8,9]。

1.2.2 藻酸鹽3D復合體構建及冰凍切片制作 原代軟骨細胞用胰酶消化后，用 2%(w/v)滅菌的藻酸鹽溶液重懸細胞，制成1×106/mL 的細胞懸液，吹打均勻；吸取20 μL滴入裝有102 mmol/L 無菌CaCl2溶液的6孔板中，藻酸鹽與軟骨細胞很快凝結成三維復合物；待復合物形狀穩定后，小心吸走無菌CaCl2溶液；將復合物分為兩組，ICA組和對照組分別加入含10 μmol/L ICA 、不含ICA的DMEM完全培養基，每組設3個復孔；在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養14 d，培養基每3 d更換1次。軟骨細胞-藻酸鹽3D復合物用PBS洗滌3次后，分為3份樣品。其中2份放入 4%多聚甲醛中固定,制作冰凍切片，切片厚度為 4 μmol/L，-80 ℃冰箱保存，用于阿利新藍組織學染色、免疫組化實驗;另外1份樣品中加TRIzol裂解，進行RNA提取，用于熒光定量PCR實驗。

1.2.3 軟骨細胞活性和酸性黏多糖合成情況觀察 采用阿利新藍組織學染色[10]。將冰凍切片從冰箱中取出，復溫5 min；用PBS洗滌3次，每次5 min。將切片放入1%阿利新藍染液中，染色10 min；用PBS洗滌3次，每次5 min。最后進行封片及鏡檢，依次進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于倒置顯微鏡下觀察拍照。成簇狀排列的軟骨細胞增多表示軟骨細胞活性增加，阿利新藍染色強度加深表示軟骨細胞酸性黏多糖合成增加。

1.2.4 軟骨細胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白檢測 采用免疫組化法。將冰凍切片從冰箱中拿取出，復溫5 min；PBS洗3次，每次5 min；3% H2O2孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。常溫下，血清封閉45 min。用濾紙吸去封閉液，直接滴加兔多克隆抗Cyclin D1(1∶3 000)、Cyclin E(1∶3 000)、β-catenin(1∶3 000)一抗工作液，4 ℃過夜，IgG作為陰性對照。次日，PBS洗3次，每次3 min。HRP標記二抗室溫下孵育 30 min。PBS 洗3次，每次3 min。DAB顯色5 min，自來水終止反應。PBS洗3次，每次3 min。蘇木素復染核30 s，自來水沖洗，封片及鏡檢。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用倒置顯微鏡下觀察拍照。在顯微鏡下，隨機選擇組織切片的3個視野計數陽性細胞和總細胞，細胞內有目標蛋白表達且呈棕色為陽性細胞[9]。蛋白陽性表達率=陽性細胞/總細胞×100%。

1.2.5 軟骨細胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。用TRIzol試劑盒對樣品進行RNA抽提，用Nanodrop 2000分光光度計測定RNA濃度；將PrimeScriptTMMaster Mix試劑盒RNA進行逆轉錄，合成cDNA。用TB GreenTMPremix Ex TaqTM進行熒光定量分析，反應程序采用兩步法。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s；60 ℃退火及延伸 34 s。以β-actin作為內參[10]，用2-△△Ct對mRNA表達進行相對定量分析。目的基因引物序列見表1。

2 結果

2.1 兩組軟骨細胞活性和酸性黏多糖合成情況 ICA組成簇狀排列的軟骨細胞明顯多于對照組，阿利新藍染色強度明顯深于對照組，并可見大量酸性黏多糖集聚與軟骨陷窩及周邊，表明ICA增加小鼠關節軟骨細胞活性和酸性黏多糖合成。見圖1。

圖1 兩組軟骨細胞活性和酸性黏多糖合成情況(阿利新藍染色)

2.2 兩組軟骨細胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白及mRNA表達比較 與對照組比較，其ICA組軟骨細胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白及mRNA表達均增加(P均<0.05)。見表2、圖2。

3 討論

膠原酸性黏多糖的蛋白核心結構上附著硫酸化糖胺聚糖(GAG)，使其形成一個大的高度帶負電荷的分子，容易與酸性染料阿利新藍結合，阿利新藍染色的深淺可反映軟骨細胞酸性黏多糖合成量的多少[11]。本研究結果顯示，10 μmol/L的ICA可促進小鼠關節軟骨細胞的增殖與活性，并能提高細胞增殖相關蛋白的轉錄和表達水平。ICA顯著增加了小鼠軟骨細胞酸性黏多糖的合成與分泌，酸性黏多糖以及Ⅱ型膠原的致密結構又將軟骨細胞圍在致密的軟骨陷窩里，保證軟骨細胞代謝的營養供給，從而提高軟骨細胞的活性[12]；同時，軟骨細胞外基質產生的因子本身也會增強軟骨細胞活性。

表2 兩組軟骨細胞Cyclin D、Cyclin E、 β-catenin的表達情況

注：與對照組比較，*P<0.05。

注：箭頭所示為目標蛋白在細胞中的表達部位。

圖2兩組軟骨細胞中Cyclin D1、Cyclin E、β-catenin蛋白表達情況(免疫組化法)

本研究顯示，在藻酸鹽3D培養下，ICA促進小鼠關節軟骨細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E 蛋白和mRNA的表達。Cyclin D1屬于周期蛋白家族成員之一，其功能是調節細胞周期，主要在G1期表達，驅動細胞向S期過渡，從而合成更多的DNA物質，為細胞分裂做準備。有研究表明，用RNA手段干擾大鼠軟骨細胞Cyclin D1表達，大鼠軟骨細胞細胞分裂停滯在G1期[13,14]。Cyclin E/周期依賴性激酶2(CDK2)復合體是細胞分裂從G1期進入S期重要的調節元件。文獻報道，ICA通過上調Cyclin E、CDK2以及下調p21、p27的表達，提高胚胎干細胞的自我更新能力[13]。β-catenin作為一種多功能的蛋白質，主要介導細胞間黏附和參與基因的表達，以此參與成骨細胞和軟骨細胞的增殖和分化[16,17]。本研究中，ICA激活了β-catenin的表達，Cyclin D1作為其靶基因和細胞分裂G1/S期的陽性助推器[18,19]，表達水平也顯著上調。但是，具體是通過HIF-1α/β-catenin通路激活β-catenin，還是Wnt/β-catenin通路調控β-catenin表達，仍需要進一步深入研究。

本研究發現，小鼠關節軟骨細胞中β-catenin與Cyclin D1、Cyclin E均表達增加。究其機制，可能是藻酸鹽這種材料使細胞聚集成團，形成內部相對致密三維立體環境[8,20,21]。這種環境與軟骨細胞本身所處的軟骨外基質非常相似，為小鼠關節軟骨細胞提供了一個適宜軟骨細胞增殖和代謝的微環境。在這種條件下，ICA通過某種信號通路，激活β-catenin的轉錄和表達，從而誘發及其下游基因Cyclin D1、Cyclin E的表達。而且，藻酸鹽具有軟骨結構非常相似的致密立體結構，有利于軟骨細胞增殖和細胞之間的信號傳遞。由此可見，ICA可以通過上調β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E表達，提高小鼠關節軟骨細胞活性，促進小鼠關節軟骨細胞增殖，該結論可為ICA用于細胞工程治療骨關節炎提供理論基礎。